【佳學(xué)基因檢測】基因檢測RASSF1A 啟動子甲基化可以指導(dǎo)前列腺癌風(fēng)險嗎？

腫瘤基因檢測與靶向藥物選擇導(dǎo)讀：

前列腺癌 (PCa) 仍然是美國男性癌癥相關(guān)死亡的賊常見原因之一。廣泛使用的前列腺特異性抗原 (PSA) 篩查受限于低特異性。其他生物標(biāo)志物如 RAS 關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域家族蛋白 1A (RASSF1A) 啟動子甲基化在前列腺癌中的診斷價值以及 RASSF1A 甲基化與病理特征或腫瘤分期之間的關(guān)系仍有待確定。因此，對已發(fā)表的研究進行了薈萃分析，以了解 RASSF1A 甲基化與前列腺癌之間的關(guān)聯(lián)。在本次調(diào)查中，共有 16 項研究涉及 1431 例病例和 565 例對照，采用隨機效應(yīng)模型進行匯總。與對照組相比，前列腺癌病例中 RASSF1A 甲基化的優(yōu)勢比 (OR) 為 14.73，95% CI = 7.58–28.61。分層分析一致顯示不同樣本類型和甲基化檢測方法的風(fēng)險相似。此外，RASSF1A 甲基化與高 Gleason 評分相關(guān)，OR=2.35，95% CI：1.56-3.53。此外，所有納入研究的匯總特異性為 0.87（95% CI：0.72-0.94），匯總敏感性為 0.76（95% CI：0.55-0.89）。按樣本類型分層的每個亞組的特異性保持在 0.84 以上，敏感性也保持在 0.60 以上。這些結(jié)果表明 RASSF1A 啟動子甲基化將成為 PCa 診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。所有納入研究的匯總特異性為 0.87（95% CI：0.72-0.94），匯總敏感性為 0.76（95% CI：0.55-0.89）。按樣本類型分層的每個亞組的特異性保持在 0.84 以上，敏感性也保持在 0.60 以上。這些結(jié)果表明 RASSF1A 啟動子甲基化將成為 PCa 診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。所有納入研究的匯總特異性為 0.87（95% CI：0.72-0.94），匯總敏感性為 0.76（95% CI：0.55-0.89）。按樣本類型分層的每個亞組的特異性保持在 0.84 以上，敏感性也保持在 0.60 以上。這些結(jié)果表明 RASSF1A 啟動子甲基化將成為 PCa 診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。

前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟

介紹

前列腺癌仍然是美國男性癌癥相關(guān)死亡的賊常見原因之一，預(yù)計 2013 年將有 29,720 人死亡 。如果通過直腸指檢和血清中的前列腺特異性抗原 (PSA) 及早發(fā)現(xiàn)前列腺癌是可以治好的 。PSA 篩查的敏感性為 80%，顯著提高了前列腺癌的早期診斷率，但 PSA 篩查的特異性僅為 20%，這可能導(dǎo)致不必要的活檢和過度治療 。因此，診斷和管理因缺乏在疾病早期階段使用的癌癥特異性診斷技術(shù)而感到困惑。迫切需要用于明確檢測和控制這種癌癥的新方法。

分子研究揭示了前列腺癌發(fā)展和進展中的重要事件，新生物標(biāo)志物的出現(xiàn)可能會提高前列腺癌的診斷水平 ?；騿幼拥漠惓?DNA 甲基化是癌細胞的特征，并且一些基因以癌癥特異性方式發(fā)生表觀遺傳改變。GSTP1 基因啟動子甲基化具有多個獨立組的廣泛特征，并且被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中具有診斷價值 。迄今為止，已有一百多個基因被報道為前列腺癌的甲基化靶標(biāo)，這可能代表了一種監(jiān)測癌癥發(fā)生和進展的有前途的方法。賊近，基于下一代測序的研究還確定了其他候選基因 。染色體區(qū)域 3p21 在多種腫瘤類型中經(jīng)常丟失（雜合子和純合子），位于該區(qū)域的 RAS 關(guān)聯(lián)域家族蛋白 1A (RASSF1A) 基因是推定的腫瘤抑制基因，與已知小鼠具有高度序列同源性蛋白質(zhì) (Nore1) 。研究表明 RASSF1 作為效應(yīng)器的作用是通過以三磷酸鳥苷依賴的方式結(jié)合 RAS 來傳播 RAS 的凋亡效應(yīng) 。RASSF1A 啟動子區(qū)域內(nèi) CpG 島的高甲基化是表達缺失的主要原因 。在許多實體瘤中，RASSF1A 的甲基化已被確定，其頻率在 30% 至 50% 之間變化 。因此，RASSF1A 甲基化影響其抑癌作用，并與不良預(yù)后相關(guān) 。

盡管在前列腺癌患者中進行了許多個體研究，但 RASSF1A 甲基化狀態(tài)在前列腺癌中的診斷價值以及 RASSF1A 甲基化與病理特征或腫瘤分期之間的關(guān)系仍存在爭議。因此，本研究的目的是對RASSF1A甲基化狀態(tài)在前列腺癌中的預(yù)后價值，以及RASSF1A甲基化與病理分期、Gleason評分、PSA水平的關(guān)系進行薈萃分析。前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟還評估了體液和組織中 RASSF1A 甲基化對前列腺癌檢測的敏感性和特異性。

前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟

材料和方法

研究選擇

以前發(fā)表的研究前列腺癌中 RASSF1 啟動子 DNA 甲基化的文章是通過使用以下關(guān)鍵詞對 PubMed 進行電子搜索來確定的；前列腺癌、PCa、RAS 關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域家族蛋白 1A 和 RASSF1A。通過已識別文章的參考列表發(fā)現(xiàn)了其他研究。本研究僅包括以英文全文發(fā)表的研究。賊后一次檢索是在 2013 年 3 月進行的。

納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

如果研究符合以下標(biāo)準(zhǔn)（1），則選擇進行分析：測量以下樣品之一中的 DNA 甲基化：血液、血漿、血清、尿液或前列腺組織；(2) 每項研究的受試者由前列腺癌患者和非癌癥對照組成；(3) 僅當(dāng)文章全文為英文時，數(shù)??據(jù)才被納入分析。排除標(biāo)準(zhǔn)是：（1） RASSF1A 甲基化僅在細胞系中進行；(2) 沒有可用的原始數(shù)據(jù)或無法檢索任何原始數(shù)據(jù)；(3)審查論文。

數(shù)據(jù)采集

對于每項研究，兩名獨立調(diào)查人員提取了以下信息，包括作者的姓氏、出版年份、國家、種族、病例類型和對照。此外，還收集了有關(guān)檢測方法類型（如 PCR）、癌癥臨床分期、PSA、Gleason 評分、引物位置、CpG 位置和引物序列的信息。詳細信息總結(jié)在表格1，表 S2和表 S3。在前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟進行敏感性和特異性分析之前，將病例和對照甲基化數(shù)據(jù)制成表格。在納入的研究中，兩類被指定為對照：正常對照和活檢陰性但患有其他疾?。ò夹郧傲邢僭錾˙PH））的患者。只有活檢證實的 PCa 和高級別前列腺上皮內(nèi)瘤變 (HGPIN) 被視為病例。因此，真陽性（TP）樣本僅限于在指示病例中具有甲基化的樣本，而假陰性（FN）則表明在病例樣本中沒有甲基化。對對照組中的假陽性 (FP) 和真陰性 (TN) 給出了相同的定義（表 S1）。

表格1

納入薈萃分析的研究特征。

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BPH，良性前列腺增生；MSP，甲基化特異性 PCR；QMSP，定量實時甲基化特異性 PCR；PYRO，焦磷酸測序；Met，甲基化；Umet，無甲基化；前列腺癌，前列腺癌；HGPIN，高級別上皮內(nèi)瘤變；強迫癥，其他癌癥疾?。?對照欄下括號內(nèi)的數(shù)字表示匹配的正常組織；#表示來自沒有前列腺癌證據(jù)的男性的正常前列腺組織。

Meta分析和統(tǒng)計分析 具有相應(yīng) 95% CI 的優(yōu)勢比 (OR) 用于檢查前列腺癌病例和對照之間 RASSF1A 甲基化頻率的差異。同樣，還檢查了 RASSF1A 甲基化與前列腺癌病理分期、格里森評分和 PSA 水平之間的關(guān)聯(lián)。為了評估研究的異質(zhì)性，對異質(zhì)性進行了統(tǒng)計檢驗。如果研究表明研究是同質(zhì)的，Q 統(tǒng)計量 P>0.05，則通過固定效應(yīng)模型計算 OR 的總結(jié)，否則，選擇隨機效應(yīng)模型。此外，還對樣本和方法進行了分層分析，使用meta回歸研究異質(zhì)性來源，并進行了敏感性分析，每次刪除薈萃分析中的單個研究以確定單個數(shù)據(jù)集對整體合并 OR 的影響，以評估穩(wěn)定性。潛在的發(fā)表偏倚通過 log [OR] 的漏斗圖對其標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SE) 進行視覺檢查，并通過 Egger 檢驗測試不對稱程度。賊后采用修剪和填充的方法得出穩(wěn)定的結(jié)論。該薈萃分析使用軟件 STATA 11.0 進行。所有 p 值均基于雙邊檢驗，p<0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。賊后采用修剪和填充的方法得出穩(wěn)定的結(jié)論。該薈萃分析使用軟件 STATA 11.0 進行。所有 p 值均基于雙邊檢驗，p<0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。賊后采用修剪和填充的方法得出穩(wěn)定的結(jié)論。該薈萃分析使用軟件 STATA 11.0 進行。所有 p 值均基于雙邊檢驗，p<0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

使用隨機效應(yīng)模型分析敏感性和特異性，在該分析中，處理了流體和組織亞組。前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟利用匯總接收操作特征 (S-ROC) 曲線來評估陽性結(jié)果的閾值定義的變化是否會在研究中產(chǎn)生敏感性和特異性值之間的關(guān)聯(lián)。每項研究對真陽性率和假陽性率的對數(shù)總和的對數(shù)優(yōu)勢比的線性回歸估計使 S-ROC 計算成為可能。當(dāng)這些數(shù)量之間的回歸為零時，采用二元數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)方法對匯總的敏感性和特異性進行獨立分析。在這些情況下，數(shù)據(jù)在對數(shù)優(yōu)勢尺度上進行分析（例如，對于特異性，使用的效應(yīng)大小為 log(Spec/(1-Spec))。

前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟

結(jié)果

研究特點

根據(jù)前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的納入標(biāo)準(zhǔn)，共有 16 項符合條件的研究，涉及 1431 例病例和 565 例對照，被納入?yún)R總分析。這些研究的特點總結(jié)在表格1. 在 16 項研究中，12 項研究使用了組織樣本和 4 項特征體液，例如血液、尿液等。使用甲基化特異性 PCR (MSP)、定量甲基化特異性 PCR (QMSP) 或焦磷酸測序監(jiān)測甲基化 RASSF1A 水平。所有病例均來自活檢證實的 PCa 或 HGPIN，而對照僅限于 BPH、健康受試者或患有泌尿生殖系統(tǒng)癌（膀胱癌）且前列腺健康的患者。11 項研究的樣本主要來自高加索人種，而 4 項研究以亞洲人群為特征，一項研究包括來自不同大陸的多個種族的受試者。前列腺癌在所有研究中均得到病理學(xué)證實。

RASSF1A 啟動子甲基化與 PCa 病例病理分期、Gleason 評分和 PSA 水平之間的關(guān)聯(lián)

在隨機效應(yīng)模型下，與非癌癥對照相比，前列腺癌病例中 RASSF1A 甲基化的匯總 OR 為 14.73，95%CI = 7.58–28.61（表 2）。在按樣本進行的分層分析中，流體樣本（OR = 26.27, 95%CI = 7.79-88.61）和組織（OR = 12.28, 95%CI = 5.86-25.76）中的 RASSF1A 甲基化風(fēng)險顯著增加。通過方法分層分析，MSP（OR 6.75, 95% CI = 3.42-13.22）和 QMSP（OR = 31.50, 95%CI = 10.95-90.62）也發(fā)現(xiàn)風(fēng)險顯著增加（圖 1A）。前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟還分析了 PCa 病例的病理分期、Gleason 評分和 PSA 水平與 RASSF1A 甲基化之間的關(guān)系。七項研究 有足夠的信息來進行此分析（表 S2），前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟發(fā)現(xiàn)除了 Gleason 評分（OR=2.35, 95%）外，具有適當(dāng)模型的組之間沒有顯著關(guān)聯(lián)CI：1.56-3.53，I 2 =32.3%）。詳細信息顯示在表3.

表 2

RASSF1A 甲基化和前列腺癌風(fēng)險的分層分析。

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MSP，甲基化特異性 PCR；QMSP，定量實時甲基化特異性 PCR；或，優(yōu)勢比；

CI，置信區(qū)間；多項研究；不適用，不適用。

圖1：顯示 RASSF1A 甲基化與前列腺癌之間關(guān)聯(lián)的森林圖。

(A) 16 項研究的森林圖表明，通過方法進行分層分析，RASSF1A 甲基化與 PCa 風(fēng)險相關(guān)。(B) 去除 6 項研究的敏感性分析后的森林圖顯示相同的風(fēng)險沒有異質(zhì)性 (p = 0.089)。菱形符號表示來自薈萃分析的總體估計及其 CI（置信區(qū)間），而其中心位于總體效應(yīng)估計的值上。菱形寬度描述了整個 CI 的寬度。

表3

RASSF1A 啟動子甲基化與 PCa 病例病理分期、Gleason 評分和 PSA 水平之間的關(guān)聯(lián)。

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或，優(yōu)勢比；CI，置信區(qū)間；PSA，前列腺特異性抗原；GS格里森分?jǐn)?shù)。

Meta回歸結(jié)果表明ORs的趨勢與甲基化檢測方法相關(guān)，這占了異質(zhì)性的一部分（系數(shù)=-1.69，p=0.024，調(diào)整后的R 2 = 47.41%），但是，其他因素如樣本類型 (p=0.525)、發(fā)表年份 (p=0.608) 和患者來源 (p=0.847) 無法解釋異質(zhì)性。前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟還進行了敏感性分析，以確定省略一項研究對整體效果的影響，其中六項獨立研究被發(fā)現(xiàn)引入了一些異質(zhì)性來源。因此，當(dāng)前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟排除由于不同類型的病例和對照而可能引入高異質(zhì)性的六項研究時，前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟觀察到異質(zhì)性降低（p = 0.089），結(jié)論穩(wěn)定（OR = 14.45, 95%CI = 8.35-25.01）（圖 1B）。

前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟沒有觀察到任何發(fā)表偏倚（Egger 檢驗；p = 0.066），并通過實施修剪和填充方法進一步證實了這一觀察結(jié)果。使用或不使用修剪和填充方法的薈萃分析沒有得出不同的結(jié)論，表明前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的結(jié)果在統(tǒng)計上是穩(wěn)健的。Egger 檢驗提示 RASSF1A 甲基化與病理分期或 Gleason 評分相關(guān)性研究不存在發(fā)表偏倚（P>0. 05）（表3）。

使用不同類型樣品的 RASSF1A 啟動子甲基化的特異性和敏感性

所有納入研究的匯總特異性為 0.87（95% CI：0.72-0.94），匯總敏感性為 0.76（95% CI：0.55-0.89）。對于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物而言，PSA的敏感性各不相同，但特異性普遍較低，約為20%，這表明RASSF1A甲基化檢測的特異性遠高于PSA檢測。異質(zhì)性的 p 值 <0.001，表明存在顯著的異質(zhì)性。沒有發(fā)表偏倚的證據(jù)（p=0.13）。此外，前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟根據(jù)樣本類型（流體/組織）將所有樣本分為兩組。在液體研究（尿液/血液/血漿）中，匯總的敏感性和特異性分別為 0.60（95% CI：0.08-0.96）和 0.93（95% CI：0.75-0.98）。對于組織研究，匯總的敏感性和特異性為 0.79（95% CI：0.64-0.89）和 0.84（95% CI：0.63-0圖 2.

圖 2：使用 S-ROC 曲線進行 Meta 分析。

SENS：靈敏度，SPEC：特異性，AUC：曲線下面積。

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討論

前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的薈萃分析結(jié)果表明，當(dāng)在尿液、血液或組織樣本中監(jiān)測時，前列腺癌中的 RASSF1A 甲基化與癌癥風(fēng)險顯著相關(guān)。它還與高 Gleason 評分的風(fēng)險增加有關(guān)。RASSF1A 的綜合特異性 (0.87) 遠高于 PSA 的特異性 (20%)。此外，按樣本類型分層的每個亞組的特異性保持在 0.84 以上，RASSF1A 的敏感性也保持在 0.60 以上。這些結(jié)果表明 RASSF1A 啟動子甲基化將是診斷 PCa 的有價值的生物標(biāo)志物。

DNA 甲基化是使癌癥中的腫瘤抑制基因失活的常見機制 。監(jiān)測異常甲基化模式有助于檢測臨床標(biāo)本（如組織活檢或體液）中的腫瘤細胞。RASSF1A是一種推定的抑癌基因，在不同類型人類腫瘤的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。以前的報告表明，RASSF1A 的遺傳變異會影響前列腺癌的易感性，并且發(fā)現(xiàn) RASSF1A 甲基化的頻率在患者組中顯著高于對照組 。為了進一步確認前列腺癌患者診斷中的 RASSF1A 啟動子甲基化狀態(tài)，前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟對涉及 1431 例病例和 565 例對照的 16 項研究進行了薈萃分析，以得出更正確的關(guān)聯(lián)估計。前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的結(jié)果表明 RASSF1A 甲基化是 PCa 的潛在危險因素，在體液和組織中均檢測到。PCa 病例中 RASSF1A 甲基化的頻率是對照組的 14.73 倍。此外，由于研究之間病例和對照之間的差異，前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟進行了敏感性分析并刪除了選定的研究以使數(shù)據(jù)更加均勻，并且觀察到前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的結(jié)論沒有重大變化。重要的是，RASSF1A 基因的頻繁甲基化與 Gleason 評分顯著相關(guān)，

如前所述，PSA 檢測具有不同的敏感性和較差的特異性（約 20%）。目前的要求是提供更高特異性而不是敏感性和補充 PSA 測試的測試。有希望的是，前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的結(jié)果表明，RASSF1A 甲基化檢測由于其高特異性而有可能補充 PSA 篩查。在這里，前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟相信順序測試模型將更有幫助，其中 PSA 測試將賊初用于識別 PSA 水平升高的患者，然后是 RASSF1A 甲基化測試以增加真實陽性。RASSF1A 檢測呈陰性的患者可以觀察等待，而結(jié)果呈陽性的個體可以推薦進行活檢。因此，順序測試將大大減少僅基于 PSA 測試的不必要的活檢建議。

本研究有幾個局限性。首先，用于監(jiān)測基因啟動子甲基化的方法的異質(zhì)性，如 MSP、Q-MSP 和焦磷酸測序。根據(jù)所進行的研究，如果能夠就標(biāo)準(zhǔn)測試達成共識將是有幫助的。與單獨使用 PCR 的方法相比，基于測序的技術(shù)通常被認為具有優(yōu)越的性能。使用下一代測序 (NGS) 檢測來監(jiān)測基因組和表觀基因組變化的迅速發(fā)展勢頭必將引領(lǐng)該領(lǐng)域的進步 ?？梢灶A(yù)見，綜合診斷測試的發(fā)展將同時測量一組生物標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄物表達和 DNA 甲基化變化，此外還可以識別每個患者的基因異常，例如基因融合和拷貝數(shù)變異 。目前的研究與其他研究一起幫助篩選出具有巨大潛力的生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物在分析通常會產(chǎn)生一長串甲基化區(qū)域的 NGS 結(jié)果時將受到特別關(guān)注。其次，這些研究中使用的不同樣本類型（包括血漿、血清、尿液、全血和組織）是異質(zhì)性的潛在來源。在這里，再次開發(fā)具有高靈敏度和特異性的高性能穩(wěn)健分析可能有助于在不久的將來克服這一問題。

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結(jié)論

這項薈萃分析表明，前列腺癌中的 RASSF1A 甲基化與不同研究人群的癌癥風(fēng)險相關(guān)。RASSF1A 是一種很有前途的生物標(biāo)志物，可用于篩查和識別 PCa，尤其是與 PSA 測試相結(jié)合以降低不必要的活檢率時?；谙乱淮鷾y序方法的更大樣本隊列和新測定的未來研究將有助于進一步加強前列腺癌的基因檢測的基因與位點收集聯(lián)盟的觀察。

Association between RASSF1A promoter methylation and prostate cancer: a systematic review and meta-analysis.

Pan J, Chen J, Zhang B, Chen X, Huang B, Zhuang J, Mo C, Qiu S.

PLoS One. 2013 Sep 20;8(9):e75283. doi: 10.1371/journal.pone.0075283. eCollection 2013.