【佳學基因檢測】基因檢測ARF 腫瘤抑制因子，知曉是否有腫瘤發(fā)生、是否會進一步惡化？

基因檢測與靶向藥物導讀

P14ARF（ARF；替代閱讀框）是一種廣泛表征的腫瘤抑制因子，它響應致癌刺激，通過 p53 依賴性和獨立途徑介導細胞周期停滯和細胞凋亡。ARF 已被證明在廣泛的人類惡性腫瘤（如結腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌）中經常通過 CpG 島啟動子甲基化而丟失，而 p14ARF 基因座中的點突變和缺失與各種形式的黑色素瘤有關和膠質母細胞瘤。雖然 ARF 主要在腫瘤發(fā)生的背景下進行研究，但它也涉及純粹的發(fā)育過程，如精子發(fā)生、乳腺和眼部發(fā)育，同時它還參與血管生成的調節(jié)。而且，已發(fā)現(xiàn) ARF 在干細胞自我更新和分化中起重要作用。與腫瘤抑制因子的情況一樣，ARF 作為一種多效性蛋白發(fā)揮作用，在發(fā)育和腫瘤發(fā)生的十字路口調節(jié)許多不同的機制。在這里，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組通過剖析 ARF 信號傳導與關鍵致癌和發(fā)育途徑的串擾，概述 ARF 在癌癥和發(fā)育生物學中的非規(guī)范功能。

關鍵詞： ARF，抑癌基因，非典型功能，癌癥生物學，發(fā)育生物學，Hippo通路，Wnt通路，Notch通路

1. 基因檢測與靶向藥物基礎知識：

在人類染色體 9p21 上發(fā)現(xiàn)的 CDKN2A 基因座編碼兩個重疊的轉錄本，它們產生兩種不同的蛋白質，p16INK4a 和 p14ARF (ARF) ，它們都是已確定的腫瘤抑制因子。P16INK4a 和 ARF 不顯示序列同一性，并通過不同的途徑發(fā)揮作用。P16INK4a 通過抑制 Cyclin D-CDK4/6 復合物發(fā)揮作用，該復合物將 Rb 蛋白維持在其活性形式 。另一方面，ARF 作為各種類型細胞應激的傳感器，包括致癌、熱休克和氧化應激 ，隨后在p53 依賴或獨立時尚 。有趣的是，ARF 被認為是 Rb 和 p53 途徑之間的中間環(huán)節(jié)，因為 Rb 失活導致 ARF 轉錄增加，進而激活 p53 依賴性檢查點 。

早期關于 ARF 對 DNA 損傷反應的作用的研究賊初忽略了它的貢獻 ，主要是因為 p53 在沒有 ARF 的情況下仍然可以被激活，然而 ARF 會因致癌刺激而升高. 這些初步研究將 DNA 損傷和致癌反應視為具有不同介質和結果的獨立過程。然而，現(xiàn)在已知癌基因激活可以觸發(fā) ARF 信號傳導，很容易導致衰老和細胞周期停滯。重要的是，在 ARF 和 DNA 雙鏈斷裂傳感器 Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) 之間建立了聯(lián)系，這表明，在癌細胞發(fā)生基因毒性應激后，ATM 會負調節(jié) ARF 蛋白水平 。值得注意的是，ARF 也被證明在 DNA 單鏈斷裂修復中發(fā)揮作用 。

關于其在癌癥生物學中的既定作用，ARF 被確定為在 DNA 損傷反應后抵御癌癥的第二道防線，其激活可能需要更高的致癌信號閾值 。ARF 還在核苷酸切除修復 (NER) 途徑中發(fā)揮關鍵作用，促進紫外線誘導的 DNA 損傷的修復 。此外，還顯示 ARF 的缺失與 BRAF 突變協(xié)同作用，導致 BRAFV600E 小鼠中紫外線誘導的 DNA 損傷和黑色素瘤形成增加 。盡管 ARF 以其在穩(wěn)定 p53 水平（包括突變 p53 的水平）中的作用而聞名 ，有趣的是，在某些肺癌 、宮頸癌 、淋巴瘤  和癌細胞系（如 HeLa 和 H1299）中報告了 ARF 表達增加，并伴有 p53 失活。值得注意的是，在 ARF 上調的甲狀腺癌等腫瘤中，ARF 異常地發(fā)現(xiàn)在細胞質中離域 。另一方面，ARF 在調節(jié)細胞骨架重塑和細胞粘附過程的細胞質中的作用也已被假設 ，從而進一步了解 ARF 在癌癥中的多效性作用。

在大多數(shù)人類癌癥病例中，ARF 和 p16INK4a 都丟失了，因此很難確定它們對腫瘤抑制的個體貢獻 。在大約 30% 的人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)了完整的 CDKN2A 基因座的改變，包括膠質母細胞瘤、胰腺癌、腺癌和黑色素瘤 。CDKN2A 基因座中染色質重塑事件的鑒定賊近開始描繪控制 ARF 和 p16INK4a 表達的遺傳機制。賊近發(fā)現(xiàn)位于 ARF 啟動子旁邊的順式元件通過長程相互作用下調 p16INK4a，從而為染色質折疊促進轉錄調控提供了一個明確的例子 。

除了廣泛表征的 ARF 作為腫瘤進展障礙的典型功能外，ARF 還涉及其他基本生物學過程，包括早期發(fā)育和形態(tài)發(fā)生。在這篇綜述中，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組試圖通過強調腫瘤抑制和發(fā)育生物學之間的重要聯(lián)系來討論 ARF 生物學的非規(guī)范方面。致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組還旨在強調 ARF 與調節(jié)癌癥和干細胞生物學主要方面的關鍵信號通路之間的相互作用。

2. ARF 在分化和形態(tài)發(fā)生中的作用

ARF 參與了許多調節(jié)細胞分化和器官發(fā)育的過程，例如眼和乳腺發(fā)育、精子發(fā)生和血管生成。結果表明，由于初級玻璃體未有效成熟為次級玻璃體  ，Arf 基因敲除導致小鼠眼睛發(fā)育成沒有功能性晶狀體的小眼睛。ARF 表達是玻璃體血管系統(tǒng) (HVS) 退化所必需的，這是眼部發(fā)育的關鍵過程，在此期間 ARF 可防止覆蓋血管的壁細胞積聚，并通過血小板衍生生長因子 (PDGF) 信號傳導維持血管穩(wěn)定性，獨立于p53 。ARF 還顯示通過 microRNA 誘導抑制 PDGF 受體合成 。值得注意的是，Arf -/- 小鼠的表型與稱為持續(xù)性原發(fā)性玻璃體增生 (PHPV) 的人類先天性眼部疾病非常相似，其中患者還表現(xiàn)出小眼和晶狀體變性 。

還發(fā)現(xiàn) ARF 可確定小鼠乳腺發(fā)育過程中細胞增殖和凋亡之間的平衡 。p19ARF（小鼠中的 p14ARF 等效物）在整個妊娠期間的黃體酮依賴性調節(jié)導致 p19ARF 誘導，而 p19ARF 的缺失導致退化早期延遲并通過 p21 下調減少細胞凋亡。p19ARF 丟失的第二個影響似乎是乳腺上皮細胞的永生化 。Yi等人的研究。(2004) 得出結論，盡管 p19ARF 對于乳腺分化可能是可有可無的，但它與黃體酮和 p21 的功能相互作用對于控制細胞增殖與細胞凋亡的平衡至關重要，可能以 p53 依賴性方式 。

精子發(fā)生過程也被發(fā)現(xiàn)在 ARF 控制下，通過該過程，位于曲細精管基底膜上的精原細胞被觸發(fā)分化為精母細胞。鑒于 ARF 在體細胞中的抗增殖作用，ARF 在有絲分裂活躍的小鼠精原細胞中上調，而 Arf -/- 雄性小鼠在前期 I 顯示睪丸萎縮并伴有 p53 依賴性細胞凋亡（失巢凋亡），這是一個悖論 。ATM 和 ARF 之間的功能聯(lián)系在雄性生殖細胞發(fā)育中仍有待闡明，因為在精原細胞中發(fā)現(xiàn) ARF 水平因輻射而下調 。ARF 的關鍵作用也被證明在促進導致精母細胞成熟的減數(shù)分裂方面 。有趣的是，穆等人。(2014) 表明，精原干細胞自我更新依賴于 Polycomb-repressive complex 2 (PRC2)，通過其在有絲分裂和減數(shù)分裂生殖細胞中的活性，抑制體細胞特異性基因以促進 ARF 獨立機制中的精原細胞分化。

ARF 在大多數(shù)胎兒或年輕成年小鼠組織中不表達，但在胎兒卵黃囊中檢測到，這是一種源自胚外內胚層 (ExEn) 的組織 。ARF 失活延遲了源自胚胎干細胞或誘導多能干細胞的胚狀體中 ExEn 譜系的分化，但是，它不影響其他生殖細胞譜系的形成 。結果表明，ARF 通過 p53 發(fā)揮作用以促進 ExEn 譜系的分化 。

角質形成細胞分化是涉及 ARF 信號傳導的另一個發(fā)育過程。研究發(fā)現(xiàn)，在人類角質形成細胞分化的早期階段，p63 水平下調，而 ARF 水平升高，這可能是由于 ARF 介導的 p63 SUMO 化和隨后的失活 。值得注意的是，伴隨 p63 缺失小鼠的嚴重皮膚和骨骼表型缺陷在 ARF 沉默后得到部分糾正，這表明在沒有 p63 的情況下，ARF 的異常上調可能與皮膚發(fā)育不相容 。

除了在細胞成熟和器官發(fā)育中的作用外，ARF 還被證明在控制血管生成方面發(fā)揮著重要作用，這是一個涉及正常和病理條件的過程。川岸等人。(2010) 表明 ARF 通過小鼠細胞系中的 p53 途徑抑制血管內皮生長因子 A (VEGFA) 的表達 。隨后在缺乏功能性 p53 表達的培養(yǎng)和異種移植的人類細胞系中進行的研究表明，在 ATM 抑制后，ARF 和 VEGF 表達之間建立了反比關系 。這些研究表明，在 p53 缺陷的背景下通過 ATM 抑制來穩(wěn)定 ARF 可能包括一種潛在的抗血管生成方法來對抗癌癥。與這些觀察結果一致，ARF 被證明可以阻止血管肉瘤的發(fā)展，可能以 p53 依賴性方式 。此外，來自 Arf -/- 小鼠的腫瘤中 CD31 陽性細胞數(shù)量增加強烈表明新血管形成，而暴露于來自 Arf -/- 巨噬細胞旁分泌信號的內皮細胞表現(xiàn)出增加的流動性，表明 ARF 缺乏促進巨噬細胞浸潤和血管生成 。

3. 干細胞生物學中的 ARF

CDKN2A 表達隨著年齡的增長而增加，隨后組織再生潛力下降。有人提出，在從干性到分化的轉變過程中，CDKN2A 基因座被重塑以對分化過程中出現(xiàn)的壓力和有絲分裂信號作出反應 。組織的再生潛力取決于干細胞靜止和自我更新之間的平衡，這兩者都是與組織穩(wěn)態(tài)有關的關鍵過程。因此，干細胞衰竭被認為是衰老的主要標志 。衰老的特征是慢性應激誘導的細胞損傷的積累，伴隨著更高的腫瘤發(fā)生率。ARF/p53 通路在整個發(fā)育和出生后的生命中在多個組織中處于休眠狀態(tài)，從成年到老年，在廣泛的組織和物種中逐漸被激活 。通過將人類 ARF 的調控和編碼序列引入斑馬魚基因組，結果表明 ARF 在截肢后的表皮鰭再生過程中增加，有助于抑制再生過程 。然而，單獨抑制 ARF 不足以使再生 。

ARF 有助于干細胞調節(jié)的一個主要機制是通過 p53 穩(wěn)定化。雖然 p53 活性降低與干細胞自我更新增加有關，但小鼠模型中 p53 過度活化導致再生潛力有限，這歸因于干細胞生態(tài)位的過早耗盡 。因此，在 p53 突變小鼠模型中報道了造血干細胞 (HSC) 的消耗，并伴有造血功能受損、乳腺形態(tài)發(fā)生破壞、神經干細胞池減少和嗅覺功能破壞，p53 突變小鼠模型具有比野生型對應物更高的 p53 活性。與這些表型一致，通過 Mdm2 消融在小鼠表皮中誘導 p53 導致干細胞活性受損和皮膚過早老化 。相比之下，具有額外 Ink4a/Arf/p53 拷貝的小鼠表現(xiàn)出壽命延長和衰老延遲，這與干細胞群的延長保存有關 。因此，有人提出在衰老過程中適度和調節(jié) ARF/p53 通路的激活會產生較慢的增殖能力，這可能有助于干細胞靜止和改善干細胞衰老，同時防止干細胞群的衰竭。為了支持這一觀點，小鼠模型中 p53 或 p21 的缺失導致干細胞庫在高齡時退出靜止狀態(tài)和長期耗盡 。

polycomb 組基因 BMI1 是許多器官中成體干細胞維持所必需的 ，被發(fā)現(xiàn)通過 CDKN2A 基因座調節(jié)細胞增殖和衰老 。雅各布斯等人。（1999 年）證明，在 Bmi1 缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞和早衰淋巴細胞中，p16INK4a 和 p19ARF 的表達均顯著增加，而 Bmi1 過表達導致成纖維細胞永生化和 p16INK4A 和 p19ARF 水平降低 。Cdkn2a 基因座的消耗顯著挽救了在 Bmi1 缺陷小鼠中觀察到的表型，使 Cdkn2a 在體內 Bmi1 靶標中變得至關重要 。根據(jù)這一觀察結果，另外還顯示 Bmi1 抑制 Ink4a/Arf 和 Hox 基因以允許嚙齒動物中的干細胞自我更新 。賊近的一項研究證實了先前報道的 Bmi1 和 Cdkn2a 基因座之間的聯(lián)系，因為它證明了 Bmi1 缺陷型先天樣 B 淋巴細胞自我更新能力的降低可以通過額外刪除 Cdkn2a 基因座來挽救 。

4. 主要信號通路的 ARF 串擾

除了作為腫瘤抑制因子的典型功能外，還發(fā)現(xiàn) ARF 和 ARF/p53 通路直接或間接參與其他關鍵信號通路的調節(jié)，這些通路在發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起重要作用。ARF 信號傳導的那些非典型功能是通過 ARF 與其他通路成分或效應器之間的各種類型的相互作用來確定的。

4.1。河馬途徑

Hippo 通路是一種進化上保守的信號通路，可主動控制器官生長發(fā)育、組織再生和上皮穩(wěn)態(tài)。其中一些功能是通過末端效應器 YAP 和 TAZ 引發(fā)的，它們通過轉錄因子結合來指導基因表達 。失調的 Hippo 通路與各種疾病有關，包括腫瘤發(fā)生，使其成分成為有希望的治療靶點。在絕大多數(shù)散發(fā)性人類惡性腫瘤中表觀遺傳沉默的腫瘤抑制因子 RASSF1A 是 Hippo 通路的上游調節(jié)因子，以促增殖 YAP-TEAD 復合物為代價驅動促凋亡 YAP-p73 復合物的形成。賊近發(fā)現(xiàn) RASSF1A 還充當植入前小鼠胚胎、小鼠胚胎干細胞和誘導多能干細胞 (iPSC) 從多能性向分化轉變所需的“分子開關”。

ARF 先前已被證明可以穩(wěn)定前列腺癌中的上皮間質轉化 (EMT) 標志物 SLUG ，同時它還通過基質金屬蛋白酶 7 (MMP7) 核易位  調節(jié)腫瘤微環(huán)境。當在 Pten/p53-null 小鼠中發(fā)現(xiàn) ARF 和 YAP 共同升高時，發(fā)現(xiàn)了 Hippo 通路和 ARF 之間的潛在串擾 。隨后的工作表明，ARF 可能會解除對人類前列腺癌細胞中 Hippo 和 Wnt 通路的調節(jié) 。從機制上講，ARF 被證明通過穩(wěn)定細胞質 YAP 并防止其核積累來解除對 Hippo 途徑的調節(jié)，這可能是通過 ARF 介導的 YAP SUMOylation。茶衍生的碳納米點與核 ARF 相互作用以使其穩(wěn)定，從而有助于 YAP 細胞質滯留，從而為靶向核 YAP 復合物的促增殖作用提供了潛在途徑 。

Forkhead Box (Fox) m1b (FOXM1) 轉錄因子是肝細胞癌 (HCC) 發(fā)展所必需的，它包含一個抑制性 ARF 靶標 。卡利尼琴科等人。(2004) 證明含有 9 個 D-Arg 的 p19ARF 肽足以抑制 Foxm1 轉錄和 Foxm1 依賴性骨肉瘤細胞生長，使 (D-Arg)9-p19ARF 26-44 肽成為腫瘤發(fā)生中潛在的 FOXM1 抑制劑。有趣的是，癌癥中的 Hippo 通路失調已被證明通過 YAP-TEAD 依賴性 FOXM1 轉錄驅動 FOXM1 激活，而 FOXM1 還直接與靶基因啟動子上的 TEAD 相互作用，促進細胞增殖和腫瘤發(fā)展 。重要的是，藥理學 FOXM1 抑制限制了體內腫瘤的大小，這意味著 FOXM1 可以潛在地作為肉瘤的治療靶點 。

Hippo 通路和 ARF 信號傳導之間的另一個潛在聯(lián)系可能源于 RASSF1A 支架蛋白已被證明可以抑制 MDM2，類似于 ARF 。RASSF1A 通過破壞細胞核中的 MDM2-DAXX-HAUSP 復合物來促進 MDM2 自泛素化和 p53 穩(wěn)定化 。雖然 MDM2 上的 RASSF1A 結合區(qū)不同于 ARF 結合區(qū) ，但 E1A 調節(jié)的轉錄因子 E4F1 可以與 ARF 和 RASSF1A 物理相互作用 ，表明 RASSF1A 可能參與 ARF-MDM2 的總體調控。除了參與 p53 穩(wěn)定化之外，RASSF1A 還涉及 p53 介導的檢查點激活以響應 DNA 損傷 。有趣的是，RASSF1A 被發(fā)現(xiàn)在 DNA 損傷時被 ATM 直接激活，從而通過 p73  為 Hippo 途徑提供促凋亡作用，而 ATM 被證明可以抑制 ARF 。鑒于 RASSF1A 積極參與 YAP-p73 介導的細胞凋亡，ATM 抑制 ARF 可能是細胞用來防止 ARF 介導的 YAP 失活的機制，至少在 p53 缺陷型腫瘤的情況下是有意義的情景。

4.2. Wnt通路

Wnt 信號轉導級聯(lián)是所有動物整個發(fā)育和成年生活中生物過程的主要調節(jié)器。異常 Wnt 信號傳導是人類多種病理狀況的基礎，包括癌癥 。Wnt 信號級聯(lián)通過依賴 β-catenin 的基因調控發(fā)揮其功能，是維持干細胞自我更新的重要參與者 。Wnt 級聯(lián)的關鍵成分的突變導致各種癌癥的發(fā)展，例如黑色素瘤、結腸直腸癌和肝癌 。由于 Wnt 通路主要參與干性的調節(jié)，因此 Wnt 通路激活在患者衍生的類器官形成中起著關鍵作用，因為它已在結腸、肺和皮膚等多種組織中得到證實. Hippo 通路支架 RASSF1A 的失活被發(fā)現(xiàn)是 Wnt 和 Hippo 通路串擾導致多能性維持所必需的，而 RASSF1A 使 Wnt 與 Hippo 信號傳導分離，以使干細胞和胚胎通過 p73 向所有細胞譜系分化 。

p14ARF、RASSF1A 和 APC1A 基因的 DNA 啟動子甲基化被認為是結直腸癌患者的獨立預后因素 。具有甲基化 p14ARF 啟動子的患者預后顯著更差，并且來自上述集合的一個或多個基因的同時甲基化與預后不良有關，而與腫瘤分期和分化狀態(tài)無關，這表明所涉及的途徑可能協(xié)同促進致癌進展和干細胞調節(jié)  (圖1）。

圖1:Hippo、Wnt 和 ARF/p53 信號通路在發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的相互作用。Hippo 通路支架 RASSF1A 被 ATM 介導的磷酸化激活 。雖然 ATM 抑制 ARF ，但 RASSF1A 和 ARF 都可以防止 MDM2 介導的 p53 降解。RASSF1A 激活導致形成穩(wěn)定的 YAP-p73 轉錄復合物，從而驅動干細胞分化和凋亡 。在沒有 RASSF1A 的情況下，YAP-TEAD 復合物通過基因轉錄驅動細胞增殖，例如FOXM1。FOXM1 被 ARF 抑制 。ARF 還抑制 Wnt 信號傳導 ，它在激活后會破壞 β-連環(huán)蛋白破壞復合物的穩(wěn)定性，導致 β-連環(huán)蛋白核易位和 TCF/LEF 介導的癌基因轉錄，例如TBX3。TBX3 抑制 ARF 以促進致癌增殖 。

有趣的是，發(fā)現(xiàn) Wnt 通路通過激活 CDKN2A 基因座來限制胚胎干細胞的自我更新 。Wnt 效應子 Tcf1 被募集到小鼠胚胎干細胞 (mESC) 的 Cdkn2a 基因座，在那里它觸發(fā) p16INK4a 和 p19ARF 的轉錄，它們充當細胞周期的負調節(jié)劑，從而降低增殖率而不影響多能狀態(tài)細胞 。mESC 中 Wnt 通路的抗增殖作用與其在體細胞中記錄的促有絲分裂作用形成對比。

達馬拉斯等人。(2001) 表明組成型活性 β-連環(huán)蛋白能夠在小鼠胚胎成纖維細胞中誘導 ARF/p53 依賴性生長停滯和衰老樣表型；然而，在沒有 ARF 或 p53 的情況下，β-連環(huán)蛋白與 Ras 合作引發(fā)致癌轉化 。盡管證明了 β-連環(huán)蛋白介導的 ARF 激活和 p53 的穩(wěn)定，Damalas 等人的研究。沒有顯示隨后的細胞凋亡誘導。其他研究表明，β-連環(huán)蛋白可能激活存活途徑以抑制 ARF/p53 途徑的促凋亡作用 。

為了識別 ARF 信號傳導的下游靶點，在人類黑色素瘤細胞系中使用野生型或突變型 ARF 蛋白進行基因表達譜分析 。對野生型和突變型 ARF 細胞系之間差異表達基因的通路分析表明，Wnt 通路成分可能作用于 ARF 信號傳導的下游，當 ARF 活性受損時有助于腫瘤的發(fā)展。與此一致，觀察到 ARF 和 Sprouty RTK 信號拮抗劑 4 (SPRY4) 之間的反比關系，SPRY4 是 Wnt 信號的進化上保守的下游靶標，因為在沒有 ARF 的情況下 SPRY4 水平增加 。此外，TBX3 也被確定為 Wnt 通路的下游靶標和 β-連環(huán)蛋白依賴性增殖和肝腫瘤發(fā)生中存活的關鍵介質 ，在抑制 ARF 表達的乳腺癌中也被發(fā)現(xiàn)上調通過與組蛋白脫乙酰酶相互作用 。值得注意的是，HDAC 抑制劑的使用能夠以劑量依賴性方式挽救 TBX3 介導的 ARF 抑制，從而為破壞 Wnt 介導的 ARF 抑制提供潛在的治療窗口 。

在 Wnt1 依賴性小鼠乳腺癌模型中證實了 p19ARF 而不是 p16INK4a 明顯參與了腫瘤逃避生長限制（如化療）的過程 。為了確定指導腫瘤逃逸的遺傳決定因素，采用了轉基因小鼠模型，其中通過阻斷強力霉素依賴性 Wnt1 轉基因表達來模擬靶向化療。通過重新激活 Wnt 通路觀察到腫瘤逃逸 。然而，影響 p16INK4a 和 p19ARF 表達的 Cdkn2a 缺失導致具有 EMT 特征的腫瘤反復，而不會重新激活 Wnt 通路。有趣的是，僅 p19ARF 缺失就能夠使 EMT 驅動的腫瘤快速逃逸，而 p16INK4a 缺乏未能加速反復，這表明無論 Wnt 通路激活如何，失調的 ARF/p53 信號傳導都可能促進乳腺癌反復 。

Cdkn2ab 基因敲除小鼠缺乏三個閱讀框（p15INK4b、p19ARF 和 p16INK4a），比 Cdkn2a -/- 小鼠發(fā)展出更廣譜的腫瘤，皮膚癌的比例更高 。賊近表明，Wnt7b 129P2 等位基因足以通過 CDK6 活性促進 Cdkn2ab -/- 細胞系的致癌轉化，CDK6 活性是一種已確定的 Wnt 靶標 。Krimpenfort 等人賊近的研究。（2019 年）表明，p15INK4b 活性的喪失（通過控制 Wnt 介導的 CDK6 活化在毛囊細胞周期中發(fā)揮重要作用）可能導致異常的祖細胞遷移和增殖。由于 p16INK4a 和 p19ARF 對響應這些致癌信號的細胞構成屏障，因此 p16INK4a 和 p19ARF 的伴隨缺失可能是皮膚腫瘤發(fā)生的易感性 。

4.3. NOTCH途徑

高度保守的 Notch 信號通路在各種情況下運行，其結果可能大相徑庭 。Notch 是一種細胞表面受體，由單個多肽鏈的細胞內蛋白水解切割形成，其兩個衍生亞基經歷二聚化并轉運至質膜 。在與 Notch 配體（Delta/Jagged 家族成員）結合后，Notch 受體被 ADAM 蛋白酶在細胞外切割，而由 γ-分泌酶進行的細胞內切割導致 Notch 細胞內結構域 (NICD) 釋放到細胞質中，其中它進入細胞核以調節(jié)靶基因的轉錄。Notch 通路激活可導致不同的結果，具體取決于細胞類型和發(fā)育階段，因為發(fā)現(xiàn)它可促進分化、干細胞維持或腫瘤發(fā)生，具體取決于每種情況下部署的靶基因集 。因此，外部信號可能對于導航 Notch 活動很重要。

T 細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL) 的兩個標志是異常的 Notch 信號傳導和 CDKN2A 基因座的缺失 。有趣的是，已經表明 Notch1 的細胞內結構域導致 T 細胞中的 Arf 激活，作為一種腫瘤抑制機制 。然而，Arf 表達伴隨著對 T-ALL 中 Cdkn2a 基因座缺失的強烈選擇壓力，從而導致克隆的存活繞過腫瘤抑制 。隨后的研究表明，Cdkn2a 基因座在培養(yǎng)的 T-ALL 起始細胞中是表觀遺傳沉默的 。然而，在異常 Notch1 信號轉導轉化的 T 細胞前體中，Cdkn2a 基因座的表觀遺傳沉默被逆轉。這使得 Arf 表達成為可能，并再次為 Cdkn2a 缺失的克隆的存活提供選擇壓力 。因此，Cdkn2a 的表觀遺傳狀態(tài)調節(jié) T 細胞成熟的發(fā)育階段，其中 Notch1 功能異常和 Cdkn2a 失活促進 T-ALL 。

LIM-only 轉錄因子 (LMO2) 基因在 T 細胞腫瘤中發(fā)生染色體易位，導致大約 9% 的 T-ALL 病例中 LMO2 表達異常增加 。在鼠 T 細胞惡性腫瘤中，Arf 失活促進胸腺細胞自我更新，并為侵襲性腫瘤的出現(xiàn)奠定了基礎 。Arf 啟動子不直接被 Lmo2 或 Notch 占據(jù)，這意味著 Notch 激活可能是 T 細胞腫瘤發(fā)生的后續(xù)事件，并且 Lmo2 誘導功能與 Arf 丟失一起促進原始胸腺細胞自我更新 。重要的是，異常的 Notch 激活和 Arf 沉默獨立地與 Lmo2 上調合作以誘導 T-ALL 。同樣，Lmo2 誘導促進從 Cdkn2a -/- 小鼠分離的星形膠質細胞的生長和神經膠質瘤干細胞表型的獲得 。有趣的是，與 ARF 在抑制血管生成  中的作用保持一致，Lmo2 能夠在 Cdkn2a -/- 背景中誘導血管生成 。

Notch 和 ARF 信號通路之間的一個關鍵功能聯(lián)系是 Polycomb 組基因 BMI1，它通過抑制 CDKN2A 基因座積極促進細胞增殖和干細胞自我更新 (圖 2）。已發(fā)現(xiàn) BMI1 是下游 Notch 靶標，其在小鼠腸道干細胞 (ISC) 中的損失伴隨著 ISC 區(qū)室增殖減少、p16INK4a/p19ARF 積累和向模仿 Notch 功能喪失的杯狀譜系分化表型 。布魯格曼等人。（2005 年）試圖探索 p16INK4a 或 p19ARF 是否對引發(fā) Bmi1 活性更為關鍵，并證明雖然 p19ARF 包含一個通用的 Bmi1 靶標，但 p16INK4a 去抑制僅在細胞類型的一個子集中起作用，例如神經干細胞，對于Bmi1 -/- 表型的表現(xiàn) 。研究結果表明 p16INK4a 與 p19ARF 在 Bmi-1 介導的細胞周期控制中的不同細胞類型特異性功能 。值得注意的是，BMI1 也被證明可以獨立于 ARF 促進人類肝癌的腫瘤發(fā)生 。BMI1 的致瘤活性似乎也獨立于人類卵巢癌細胞中的 ARF 信號傳導，其中遺傳或藥理學 BMI1 抑制會損害克隆生長而不影響 CDKN2A 基因座的表達或 ARF 蛋白穩(wěn)定性 。所提出的機制涉及通過 ATP 消耗誘導自噬，因為 BMI1 的靶向觸發(fā)了 PINK1-PARK2 依賴性線粒體途徑，從而導致壞死性凋亡 。

圖 2:Notch 和 ARF/p53 信號通路之間的相互作用。Notch 是一種跨膜受體，在被 γ-分泌酶切割后，會產生一個胞內結構域 (NICD)，該胞內結構域 (NICD) 能夠轉運至細胞核并直接調節(jié)基因轉錄。BMI1 被 Notch 激活以調節(jié)細胞增殖和干細胞自我更新，尤其是在神經組織中 。Notch 和 Bmi1 都直接占據(jù) Arf 啟動子以抑制 Arf 表達 ，從而擾亂 Arf 介導的 p53 穩(wěn)定化。

另外據(jù)報道，Notch 通過抑制 Arf 表達來抑制小鼠 T 細胞淋巴瘤形成中的 p53，而 p53 在 Notch 信號傳導受到 γ-分泌酶抑制劑的干擾時被激活 。隨后的一項研究表明，Notch 通過直接占據(jù) Arf 啟動子來抑制 Arf，其中 Polycomb 抑制復合物 2 (PRC2) 以 LSD1 依賴性方式被募集，允許組蛋白修飾賊終終止 Arf 轉錄(圖 2) 。相反，Notch 刺激已被證明可激活肌肉干細胞中的 p53，從而通過 Hey 轉錄因子促進肌肉再生 。然而，在老年動物中觀察到 Notch 信號傳導延遲，導致 p53 抑制獨立于 p16INK4a 或 p19ARF，從而導致肌肉細胞再生潛力的下降 。

5. 討論

ARF 是一種腫瘤抑制蛋白，在腫瘤發(fā)生的重要方面具有確定的作用，例如 DNA 損傷反應。除了眾所周知的 p53 穩(wěn)定劑功能外，ARF 還與 p53 非依賴性機制有關，以促進細胞生長停滯 。有趣的是，在某些腫瘤類型中也發(fā)現(xiàn) ARF 信號上調，例如在伯基特淋巴瘤或大多數(shù) p53 突變腫瘤中 。為了賊終確定 ARF 信號傳導的影響，ARF 仍需要與 p16 分開研究，因為 CDKN2A 基因座的兩個轉錄本似乎在神經干細胞自我更新和分化等過程中具有不同的作用 。

在這篇綜述中，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組試圖總結關于 ARF 信號在癌癥和發(fā)育生物學中的非典型作用的關鍵發(fā)現(xiàn)。此外，鑒于發(fā)育和腫瘤發(fā)生通常受類似機制控制，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組概述了單獨的 ARF 或 ARF/p53 通路與主要信號通路之間的串擾，在這兩種情況下都具有關鍵作用。積累的證據(jù)表明，ARF 是一種多效性蛋白，根據(jù)細胞類型、發(fā)育階段和突變負荷，具有不同的調節(jié)因子和相互作用因子。通過強調 ARF 和其他通路成分之間的相互作用，重要的信號轉導過程之間可能會出現(xiàn)新的聯(lián)系，從而為探索旨在糾正發(fā)育缺陷和限制腫瘤生長的新治療方法提供可能性。例如，，或觀察到 Notch 信號與人類腫瘤（如肺和乳腺）中的 RASSF1A 表達負相關 ，結合 RASSF1A 和 ARF 介導的 p53 調節(jié)，提供了 RASSF1A–值得探索的 ARF。沿著這些思路，Notch 轉錄靶標 BMI1 是發(fā)育過程中 ARF 表達的主要調節(jié)因子 ，已知對阿爾茨海默病等退行性疾病具有神經保護作用。因此，Notch-BMI1-ARF 軸構成了該領域的一個重要臨床靶點，可以潛在地進行治療利用。

Non-Canonical Functions of the ARF Tumor Suppressor in Development and Tumorigenesis.

Lagopati N, Belogiannis K, Angelopoulou A, Papaspyropoulos A, Gorgoulis V.

Biomolecules. 2021 Jan 12;11(1):86. doi: 10.3390/biom11010086.