【佳學基因檢測】基因檢測如何指導視網(wǎng)膜色素變性的基因治療

視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一組遺傳性眼病，主要影響視網(wǎng)膜中的感光細胞，導致視力逐漸喪失?；驒z測在RP的診斷和治療中發(fā)揮著重要作用，能夠識別與疾病相關的特定基因變異，為個性化治療提供依據(jù)。

1. 基因檢測

基因檢測通過對患者的基因組進行測序，識別與RP相關的突變。例如，CNGB1和RPGR基因的變異已被證明與常染色體隱性和顯性RP相關。研究顯示，CNGB1的變異可能占arRP病例的4%。此外，使用大型患者隊列的基因組測序，可以發(fā)現(xiàn)更多與RP發(fā)病機制相關的新靶點，如SLC66A1和SLC39A12。

2. 基因治療

基因治療是RP治療的前沿領域，旨在通過修復或替換缺陷基因來改善或恢復視力。近年來，科學家們利用AAV載體和CRISPR技術開發(fā)了多種基因治療策略。例如，通過AAV載體恢復CNGB1的表達能夠顯著改善視力。此外，研究者們正在探索RPGR基因的修復方法，以恢復視網(wǎng)膜功能。

總的來說，基因檢測和基因治療的結合為RP患者提供了新的希望，能夠在未來實現(xiàn)更有效的個性化治療。

3.  常染色體顯性連鎖突變

常染色體顯性遺傳病是研究最多的亞型，因為它們的嚴重性；單個等位基因突變即可引起表型的改變。與常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性（adRP）相關的突變占病例的50%至75%。因此，迫切需要針對這些基因開發(fā)新治療方法。已知許多基因與adRP的發(fā)病機制有關。在《基因檢測如何指導視網(wǎng)膜色素變性的基因治療》中，總結了研究較多的基因（如RHO）及其他分子靶點的新進展。

3.1. 視紫紅質(zhì)誘發(fā)的常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性

在視網(wǎng)膜色素變性（RP）患者中，最常見的突變之一是RHO基因突變，影響近25%的患者。近年來，針對視紫紅質(zhì)相關RP的治療方法的臨床前研究得到了大量關注。RHO突變引起的發(fā)病機制和生物分子變化已在細胞系和動物模型（主要是嚙齒動物）中得到了深入研究。在建立了有效的動物模型后，科學界的興趣轉(zhuǎn)向了基因治療載體的開發(fā)。

目前，針對表現(xiàn)出視紫紅質(zhì)突變的哺乳動物模型的研究取得了新進展，使得基因治療的臨床前階段主要集中在adRP的治療上。盡管如此，最近的研究在體內(nèi)模型中更好地表征了RHO基因在RP發(fā)病機制中的作用。例如，在非洲爪蟾蝌蚪中，通過CRISPR-Cas9誘導的RHO突變顯示，桿狀細胞的變性是由于Müller膠質(zhì)細胞增殖受抑制所致。在轉(zhuǎn)基因大鼠模型中，脯氨酸被亮氨酸（P347L）取代后，視紫紅質(zhì)的積累導致外核層迅速破壞。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路在P347L轉(zhuǎn)基因大鼠中通過顯著上調(diào)CHOP和BiP mRNA的表達而被激活。

研究表明，在轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬中，視紫紅質(zhì)突變P347S會影響視紫紅質(zhì)向光感受器外段的轉(zhuǎn)運。Mussolino及其同事使用鋅指DNA結合結構域的轉(zhuǎn)錄抑制方法，通過含有KRAB（Krüppel相關框抑制物）結構域的AAV2/8載體成功轉(zhuǎn)染RHO P347S轉(zhuǎn)基因小鼠，導致ERG反應增強。該方法能夠降低突變體的轉(zhuǎn)錄水平，而不改變內(nèi)源性小鼠RHO基因的表達。最近的研究顯示，將鋅指與KRAB結構域融合，并結合由GNAT1啟動子驅(qū)動的RHO cDNA，可以在載體遞送后恢復RHO基因的野生型拷貝。Marrocco及其同事通過視網(wǎng)膜下注射成功抑制了含有突變RHO基因的豬體內(nèi)的內(nèi)源性表達，并用RHO的野生型拷貝取而代之，導致視網(wǎng)膜形態(tài)和功能的恢復。RNA替代療法在動物模型中也顯示出了有效性。使用P347S轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究表明，通過載體遞送shRNA可以替換突變的視紫紅質(zhì)RNA轉(zhuǎn)錄本，從而導致視紫紅質(zhì)水平的升高和隨后的ERG反應增強。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在S334ter-3大鼠中也取得了成功，該大鼠具有特定等位基因RHO S334的突變，治療可改善視網(wǎng)膜的保存和視力。在RHO-P347S/Rd10和Rd10/Rd1小鼠中，分別通過視網(wǎng)膜下注射AAV-Cas9載體對Nrl和Nr2e3基因進行敲除，也獲得了有希望的結果。NRL和NR2E3是參與視桿感光細胞分化和細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵因子，調(diào)節(jié)它們被證明是治療RP的有效方法。miRNA水平的失調(diào)與RP的發(fā)病機制有關。miR-204突變與視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良有關。Karali及其同事證明，在RHO-P247S轉(zhuǎn)基因小鼠中注射AAV介導的pre-miR-204可以延緩視網(wǎng)膜退化，并減弱小膠質(zhì)細胞活化和感光細胞死亡，從而增強視網(wǎng)膜功能。此外，基于mirtron的miRNA表達調(diào)控在RP小鼠模型中成功抑制了基因表達。在Nrl.GFP/+、Rho P23H/+小鼠中，視網(wǎng)膜下注射AAV-mirtron載體（即AAV-M3.M5 H.RHO M3/5R）已被證明可以誘導視紫紅質(zhì)mRNA的替換，從而部分挽救視網(wǎng)膜變性。此外，還研究了攜帶視紫紅質(zhì)基因突變的Tvrm4小鼠，以了解Myriocin（一種神經(jīng)酰胺從頭合成抑制劑）的作用。Myriocin可以降低視網(wǎng)膜神經(jīng)酰胺，保持視網(wǎng)膜電圖記錄反應，并降低視網(wǎng)膜氧化應激，表明它可能通過解毒和支持細胞存活起到作用。

視紫紅質(zhì)T17M突變體參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致的未折疊蛋白反應（UPR）通路的異常激活，并誘導感光細胞死亡。在轉(zhuǎn)基因C57BL6小鼠的研究表明，T17M視紫紅質(zhì)的表達會誘導IL-1β、IL-6和NFκB以及IB1A小膠質(zhì)細胞標志物的上調(diào)。UPR通路的持續(xù)激活與感光細胞功能和視網(wǎng)膜結構的喪失有關。在C57Bl/6小鼠的研究中，單次敲低(ATF4 +/−) T17M就足以產(chǎn)生治療反應，顯著延緩視網(wǎng)膜變性，而雙重敲低則增強了觀察到的效果。T17M誘導的RP小鼠中ATF4缺乏與pEIF2α、ATF6和CHOP表達的下降有關。

3.2. 非視紫紅質(zhì)相關常染色體顯性突變

前mRNA加工因子（PRPF）突變與多達20%的adRP病例相關。PRPF參與前mRNA剪接，且已知參與纖毛發(fā)生和DNA損傷修復途徑。使用AAV相關的CRISPR-Cas9載體進行基因增強，結果表明Prpf31基因增強可恢復小鼠視網(wǎng)膜結構的完整性。在Rpgr−/y Cas9+/WT小鼠中，使用sgRNA（Cas9）和AAV載體進行Rpgr基因編輯可誘導光感受器的保存。

與adRP相關的RP1基因突變會破壞光感受器內(nèi)的蛋白質(zhì)運輸、纖毛結構的維持和視盤膜的穩(wěn)定性，最終導致光感受器細胞的死亡。最近，雙Cas9/sgRNA被證明可以成功降低編輯后的Hap1-EF1a-RP1細胞中的RP1表達，為進一步的臨床試驗鋪平了道路。

4. 常染色體隱性連鎖突變

4.1. 視紫紅質(zhì)誘發(fā)的常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性

與adRP的遺傳形式類似，許多RHO突變已被證明與經(jīng)典形式RP（例如adRP）相關，而只有少數(shù)與隱性形式相關。根據(jù)基因檢測結果，adRP的RHO突變通常分為七類。然而，只有五個RHO突變被證明與常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性（arRP）相關。與視紫紅質(zhì)相關的arRP的五個已知變體包括E150K、W161ter、E249ter和M2531突變。佳學基因檢測還在視力障礙患者中發(fā)現(xiàn)了與RHO相關的錯義突變（E150K）。敲入小鼠模型表明，E150K 突變會損害視紫紅質(zhì)的穩(wěn)定性，導致進行性視網(wǎng)膜變性。這些觀察結果可以在基因解碼的幫助下，通過混亂的感光器盤結構隨后損害正常的吞噬作用來解釋。純合 E150K 小鼠的視網(wǎng)膜中 Müller 細胞活化程度更高，巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞也更多，這為視網(wǎng)膜免疫激活提供了證據(jù)。發(fā)現(xiàn)兩個無義突變（E249ter 和 W161ter）與 arRP 有關。使用轉(zhuǎn)染了視紫紅質(zhì)無義突變體的 HEK293 和 HT1080 人細胞系檢測到了較低水平的視紫紅質(zhì) mRNA，提示存在無義介導的衰變（NMD）；用已知的 NMD 抑制劑 Wortmannin 處理細胞，可恢復視紫紅質(zhì) mRNA 水平。M2531 視紫紅質(zhì)突變體被證實與 arRP 形式有關，來自土耳其近親血統(tǒng)的雜合子患者無癥狀 。佳學基因檢測進一步研究以更好地了解常染色體隱性突變在 RP 發(fā)展中的作用和影響。

4.2 非視紫紅質(zhì)相關常染色體隱性突變

基因解碼基因檢測發(fā)現(xiàn)，CNGB1基因的序列變異與常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性（arRP）有關，約占該病癥病例的4%。最近對CNGB1變異的基因檢測結果的綜合分析指出，共有62種遺傳變異與遺傳性視網(wǎng)膜疾病相關。基因解碼基因檢測表明，利用AAV載體恢復Cngb1−/−小鼠的CNGB1表達能夠改善視力，這些小鼠在視桿依賴性視覺引導行為測試中表現(xiàn)優(yōu)異 (pp.733–739)。此外，視網(wǎng)膜的變性速度顯著減緩，形態(tài)得以保持。

基因檢測還發(fā)現(xiàn)，TULP1突變與早發(fā)性視網(wǎng)膜變性相關，盡管其具體發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來，研究人員開始關注使用斑馬魚模型來探討各種視網(wǎng)膜疾病的致病機制。他們建立了Tulp1表達的單敲除（Tulp1 +/−）和雙敲除斑馬魚模型，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)微管成分tektin2會顯著影響纖毛的形成。通過AAV介導的TULP1基因表達編輯，成功恢復了TULP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平。然而，TULP1的基因表達恢復并不足以改善Tulp1 −/−小鼠的外核層厚度。

開發(fā)新動物模型用于基因治療是藥物發(fā)現(xiàn)的一個重要途徑。最近，Beryozkin及其同事成功創(chuàng)建了Fam161a缺乏的小鼠模型，這些小鼠顯示出視網(wǎng)膜變性表型及增加的小膠質(zhì)細胞等分子生成標記。同樣，純合Fam161a p.Arg512∗小鼠因外核層完全喪失和感光細胞死亡而出現(xiàn)視力改變。

RPGR基因已被證實與隱性RP相關，是研究最廣泛的基因之一。盡管AAV載體在治療方面顯示出良好的臨床前潛力，但研究者們?nèi)栽谔剿鞫喾N基因治療方法。最近的研究使用rd9小鼠模型，注射AAV引導的CRISPR-cas9載體，成功恢復了RPGR ORF15的閱讀框。

5 識別與視網(wǎng)膜色素變性有關的基因靶點，用于新型基因治療

為了開發(fā)未來的基因療法，通過致病基因鑒定基因解碼識別與RP發(fā)病機制相關的新基因顯得尤為重要。針對大型患者隊列的基因測序研究為未來的基因靶點提供了重要線索。近年來，多個研究通過基因組測序揭示了可能與RP發(fā)病機制相關的多種基因。例如，佳學基因通過分析以色列和巴勒斯坦的遺傳性視網(wǎng)膜疾病病例，發(fā)現(xiàn)了兩個新的靶點：SLC66A1和SLC39A12 。其他SLC基因變體也與RP相關；SLC7A14基因敲除小鼠表現(xiàn)出視網(wǎng)膜變性和視覺功能障礙，表明該基因在視網(wǎng)膜發(fā)育中發(fā)揮重要作用。ATP/GTP結合蛋白的稀有雜合變體（如AGBL5的p.Arg281Cys和p.Arg487*）也可能與RP相關?？傮w而言，這些新基因在RP中的病理生理學仍需進一步研究。關于導致視網(wǎng)膜疾病的基因及其定位位點的最新列表，可在《視網(wǎng)膜相關疾病及其基因突變位點列表》。

6 RNA替代療法

基因檢測與視網(wǎng)膜變性基因治療的研究正在不斷進展，特別是在RNA替代療法方面。RNA替代療法的目標是消除內(nèi)源性突變RNA，這一過程涉及非編碼RNA（ncRNA）的調(diào)控。ncRNA主要分為微小RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA）。其中，miRNA通過結合靶信使RNA（mRNA）的結合位點來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾，從而抑制翻譯并導致mRNA的不穩(wěn)定。siRNA與miRNA有相似的作用機制，但其結合能力更為特異，可以識別單個核苷酸差異。shRNA在基因治療中則主要用于DNA遞送。

在視網(wǎng)膜色素變性（RP）的治療中，多個基因突變被發(fā)現(xiàn)與其發(fā)生相關。盡管目前尚無治愈RP的療法，研究者們正在開發(fā)針對特定基因的藥物（如基因療法），以挽救細胞并支持人工視網(wǎng)膜的維持。

基因突變的作用機制和信號通路的研究為新藥的開發(fā)提供了基礎。例如，通過CRISPR-Cas9技術對特定基因的編輯，能夠在模型生物中恢復視網(wǎng)膜功能。這些新發(fā)現(xiàn)為RP的治療開辟了新的可能性。

總之，基因檢測和基因治療結合了最新的分子生物學技術，為治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病帶來了新的希望。