【佳學(xué)基因檢測】CDH13和MGMT基因啟動子甲基化基因檢測與原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌病理診斷與治療選擇

啟動子甲基化基因檢測與原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌導(dǎo)讀：

介紹

全身甲基化變化可能是腫瘤發(fā)展或預(yù)后的診斷標(biāo)志物。在這里，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組研究了肺腫瘤中基因甲基化與正常肺組織之間的關(guān)系，以及是否可以在配對血液樣本中檢測到 DNA 甲基化變化。

材料與方法

65 名患者在一個(gè)機(jī)構(gòu)參加了非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 的手術(shù)病例系列。使用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序，在肺腫瘤、病理正常肺組織和來自登記病例的循環(huán)血液中的五個(gè)基因( RASSF1A、CDH13、MGMT、ESR1和DAPK )上對CpG 甲基化進(jìn)行了量化。

結(jié)果

與正常肺組織相比，腫瘤中甲基化的分析確定了 CDH13、RASSF1A 和 DAPK 基因的更高甲基化，而 ESR1 和 MGMT 甲基化在這些組織類型之間沒有顯著差異。然后甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組檢查了是否可以在血液中檢測到這三個(gè)異常甲基化基因。在腫瘤中觀察到的甲基化差異并未反映在匹配血液樣本的甲基化狀態(tài)中，這表明通過在基于血液的測試中分析這些基因來檢測肺癌的可行性較低。最后，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組探討了腫瘤甲基化是否與臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征相關(guān)。組織學(xué)和性別與CDH13基因的甲基化相關(guān)，而分期與MGMT的甲基化相關(guān)。

結(jié)論

甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的結(jié)果顯示，與正常肺相比，肺腫瘤中RASSF1A、CDH13和DAPK基因的甲基化程度更高。非小細(xì)胞肺癌患者血液樣本中這些甲基化變化缺乏反映表明它們不太適合篩查測試。
關(guān)鍵詞：甲基化，非小細(xì)胞肺癌，CDH13，MGMT，臨床病理特征

介紹

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見原因之一。在基因檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用過程中，診斷方法和治療取得了進(jìn)展。
基因表達(dá)的表觀遺傳控制在致癌作用中起重要作用。CpGdi 核苷酸的異常甲基化是人類癌癥中常見的表觀遺傳修飾，它似乎比癌癥中的基因突變更頻繁。雖然腫瘤以全基因組低甲基化為特征，但腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域的高甲基化已被提出，相當(dāng)于突變事件的轉(zhuǎn)錄沉默機(jī)制。
肺癌中的 DNA 甲基化變化已得到充分證實(shí)，將這些知識轉(zhuǎn)化為篩查具有顯著改善健康的潛力。隨著新的疾病篩查標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有可能實(shí)現(xiàn)早期診斷，為癌癥治療做出更明智的選擇，并確定與預(yù)后和治療反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物。有人提出，在不久的將來，有可能使用 DNA 甲基化特征篩查肺癌患者，測量患者對治療的反應(yīng)，識別風(fēng)險(xiǎn)增加的患者，或監(jiān)測旨在降低癌癥發(fā)病率的干預(yù)措施。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，有必要證明表觀遺傳變化對癌細(xì)胞的特異性，并評估在容易接近的組織(即循環(huán)血液)中檢測異常的敏感性。
據(jù)報(bào)道，許多基因在肺腫瘤中異常甲基化。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組檢查了文獻(xiàn)以確定一組在肺腫瘤中最常被鑒定為高甲基化的基因，有利于那些報(bào)道了高甲基化與臨床病理學(xué)特征之間可能相關(guān)的基因。這導(dǎo)致使用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序?qū)σ唤M五個(gè)基因(RASSF1A、CDH13、MGMT、ESR1 和 DAPK)進(jìn)行調(diào)查，以確定這些甲基化變化是否對肺腫瘤具有特異性，并測試這些變化是否可以在患者的血液樣本中檢測到。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組進(jìn)一步分析了 DNA 甲基化與臨床病理學(xué)特征之間可能存在的關(guān)聯(lián)。

材料與方法

原發(fā)腫瘤樣本 (n=65)、相應(yīng)的非惡性肺組織 (n=65) 和機(jī)械血液樣本 (n=51) 來自于 2009 年在肺病研究所接受治好性切除手術(shù)治療的 NSCLC 患者，臨床貝爾格萊德大學(xué)塞爾維亞中心。該研究得到了該機(jī)構(gòu)倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得了所有研究參與者的知情同意。使用 EDTA 真空采血管收集 5 mL 血液，并在 -20 C 下儲存直至處理。使用 Higuchi 描述的方法從全血樣品中提取 DNA。簡而言之，通過加入等體積的裂解緩沖液(0.32 M 蔗糖、10 mM Tris-HCl pH 7.5、5mM MgCl2 和 1% Triton X-100)裂解血細(xì)胞和血小板。將裂解物以 3,000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘。去除上清液，再次對沉淀進(jìn)行裂解和離心。去除上清液后，將顆粒懸浮在 3 mL 緩沖液(10 mM Tris-HCl、0.4 M NaCl、2 mM EDTA 和 25 μL 蛋白酶 K)中，然后加入 SDS(0.7% 終濃度)。在 37°C 孵育過夜后，加入 1 mL 6M NaCl，并通過離心使蛋白質(zhì)沉淀。將含有 DNA 的上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，并以 4000 rpm 的速度離心 10 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，加入等體積的異丙醇。DNA變得可見并被轉(zhuǎn)移，在 1 mL 70% 乙醇中洗滌并風(fēng)干，然后重懸于蒸餾水中并通過瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)量，并使用 Nanodrop 分光光度計(jì)(ThermoScientific Inc.，Wilmington，DE)進(jìn)行定量。如前所述從新鮮冷凍腫瘤中分離 DNA。隨后的實(shí)驗(yàn)室研究在美國明尼蘇達(dá)大學(xué)共濟(jì)會癌癥中心進(jìn)行。DNA甲基化的檢測基于用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。根據(jù)制造商的方案 (Zymo Research, Irvine, CA) 對基因組 DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。然后生成鏈特異性聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，為焦磷酸測序提供合適的 DNA 模板(表格1)。RASSF1A、CDH13、MGMT和DAPK基因的引物序列和 PCR 條件已在之前描述過。為了便于與其他出版物進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，引物序列以及每個(gè)基因內(nèi)分析的序列顯示在表格1. 通過瓊脂糖電泳分離擴(kuò)增子以確認(rèn)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增和產(chǎn)物質(zhì)量。使用 PyroMark 軟件 (Qiagen) 計(jì)算每個(gè)啟動子的每個(gè) CpG 的甲基化百分比以及跨 CpG 的平均甲基化。

表格1：通過焦磷酸測序?qū)駿SR1、RASSF1A、CDH13、MGMT和DAPK進(jìn)行啟動子甲基化分析：顯示的是擴(kuò)增引物(正向和反向)、使用的測序引物和分析的序列。

	ESR1	RASSF1A	CDH13	管理時(shí)間	DAPK
正向引物	TTTTGGGTTATTTTTAGTAG ATT	生物素-ATAGGTTTTGTTTAATGAGT	TTGGGAAGTTGGTTGGTTG	TTGGTAAATTAAGGTATAGA GTTTT	GAGGGTAGTTTAGTAAGTTG TTATAG
反向底漆	生物素- CAAAAAACAACTTCCCTAAAC T	CTACACCCAAATTTCCATTAC	生物素- ACAACCCCTCTTCCCTACCT	生物素-AAACAATCTACRCATCCT	生物素- CCTCCAACTACCCTACCAAA
測序引物	GGTTATTTTTAGTAGATTTT	ATCTAAATCCTAAAAAAAAC	GGAAAATATGTTTAGTGTAG	GGAAGTTGGGAAGG	TTTAGTAATGTGTTATAGGT
分析序列	YGTGYGTTTTYGTTTTTTGGTY GTG	RCTAAAATCRAAACCCRCCCT ATAACCCCRCCCRACCCRCRC TTACTAACRCCCAAAACCAAC RAAACACRAACCCAACCRAAC C	TYGYGTGTATGAATGAAAAY GTYGTYGGGYGTTTTTA	YGTYGTTYGGTTTGTATYGGT _	GGGGYGTTYGYGTTTYGGGY GGAYGTATTGGTTTTTYGGTY GGYGTGGGTGTGGGGYGAG TGGGTGTGTGYGGGGTGTGY GYGGT
測序引物 2	AATTTAGTTTTTATTTAGTA
分析序列 2	GYGAYGATAAGTAA

統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算每個(gè) CpG 位點(diǎn)的描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以及每個(gè)基因的多個(gè) CpG 的平均值。由于數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布的，因此計(jì)算了連續(xù)變量的中位數(shù)和四分位距 (IQR)。創(chuàng)建箱線圖以直觀地評估每個(gè) CpG 位點(diǎn)的值分布。由于甲基化值的非正態(tài)性，組織類型之間的甲基化差異使用配對 Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)對基因區(qū)域內(nèi)所有 CpG 位點(diǎn)的平均甲基化值進(jìn)行評估。使用單個(gè) CpG 位點(diǎn)或平均 CpG 位點(diǎn)產(chǎn)生了類似的結(jié)果。
對于那些甲基化值與基因內(nèi) CpG 位點(diǎn)的平均甲基化值與正常組織值的平均值相差三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的樣本，腫瘤高甲基化被分配。. 甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組使用 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較了腫瘤樣本中存在和不存在高甲基化的患者血液樣本中的甲基化。使用Fisher正確檢驗(yàn)評估腫瘤高甲基化與患者和腫瘤特征之間的關(guān)聯(lián)。評估的變量包括估計(jì)的患者年齡(<55、55-59、60-64、>65)、性別(男性、女性)、吸煙(當(dāng)前、以前/從未)、包裝年數(shù)(<40、40-70、>70 )、組織學(xué)(鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和其他)、分級(<2、2、>2)和分期(I、II、III、IV)。由于只有出生年份可用，因此估計(jì)了患者年齡；用當(dāng)年的7月1日來估計(jì)年齡。所有分析均使用 SAS 9.2 (SAS Institute, Inc, Cary, NC) 進(jìn)行。

結(jié)果

患者特征在表 2. 男性患者多于女性患者。大多數(shù)患者 (81.3%) 是當(dāng)前吸煙者，15.6% 是前吸煙者。特定的組織學(xué)亞型包括 20 種 (30.8%) 腺癌、35 種 (53.8%) 鱗狀細(xì)胞癌和 10 種 (15.4%) 其他 NSCLC 亞型(4 種大細(xì)胞癌、3 種巨細(xì)胞癌、1 種非典型類癌、1 種粘液癌和 1 種肉瘤樣癌)。

表 2:受試者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、腫瘤組織學(xué)、分級、分期和吸煙狀況數(shù)據(jù)

多變的	級別	頻率 (％)

年級	<2	21 (33.3)
	2	23 (36.5)
	>2	19 (3??0.2)
	失蹤	2

組織學(xué)	鱗狀細(xì)胞癌	35 (53.8)
	腺癌	20 (30.8)
	其他	10 (15.4)

階段	1	16 (25.0)
	2	25 (39.1)
	3	19 (29.7)
	4	4 (6.3)
	失蹤	1

性別	女性	21 (32.3)
性別	男性	44 (67.7)

吸煙狀況	當(dāng)前的	53 (81.3)
	以前的	10 (15.6)
	沒有任何	2 (3.1)
	失蹤	1

包年	< 40	18 (28.6)
	40–70	33 (52.4)
	>70	12 (19.0)

估計(jì)年齡	<55	14 (21.5)
	55–59	17 (26.2)
	60–64	15 (23.1)
	>=65	19 (29.2)
	平均值 (SD)	60.00 (6.86)

每個(gè)基因的 CpG 位點(diǎn)的甲基化分布在圖1. 對于所研究的每個(gè)基因，CpG 位點(diǎn)的甲基化百分比相當(dāng)相似。腫瘤樣本顯示出更多的甲基化變異，每個(gè) CpG 位點(diǎn)都有大量異常值。對于所有 CpG 位點(diǎn)，血液樣本的甲基化水平往往較低。
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圖1:圖形表示(箱線圖)比較腫瘤 (T)、正常肺組織 (N) 和血液樣本 (B) 中的 DNA 甲基化水平。通過分析單個(gè)基因和 CpG 位點(diǎn)獲得結(jié)果。
與正常肺組織相比，腫瘤中五個(gè)基因中三個(gè)(DAPK、RASSF1A和CDH13)的甲基化顯著升高(表3)。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組接下來研究了是否可以在循環(huán)血液樣本中檢測到這三個(gè)基因的甲基化變化。病例被分類為腫瘤中每個(gè)基因的甲基化陽性或陰性。從血液中分離的 DNA中DAPK、RASSF1A、MGMT和CDH13的平均啟動子甲基化與腫瘤甲基化狀態(tài)之間沒有顯著相關(guān)性(表 4) 然而，對于那些在 ESR1 基因的腫瘤中具有高甲基化的人來說，血液中的甲基化之間存在顯著的關(guān)聯(lián)。

表3:手術(shù)切除時(shí)切除的腫瘤組織和病理正常肺樣本中五個(gè)抑癌基因的 CpG 甲基化平均差異

基因	甲基化變化(甲基化腫瘤- 甲基化正常肺)

	ñ	中位數(shù) (IQR a )	p 值b

CDH13	64	2.43 (-1.41, 6.9)	<0.001
RASSF1A	62	0.91 (-0.15, 11.7)	<0.001
ESR1	65	0.28 (-0.67, 1.46)	0.07
管理時(shí)間	64	0.12 (-0.27, 0.95)	0.08
DAPK	47	0.87 (-0.97, 2.26)	0.03

a IQR = 四分位距
b人體內(nèi)甲基化差異的 Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)(腫瘤與正常肺)

表 4:按腫瘤甲基化狀態(tài)分層的循環(huán)血液樣本中的 DNA 甲基化

		循環(huán)血液中的平均 CpG 甲基化				p 值b

基因	高甲基化的臨界值	腫瘤中的高甲基化		腫瘤中沒有高甲基化
基因	高甲基化的臨界值	ñ	中位數(shù) (IQR)	ñ	中位數(shù) (IQR)

CDH13	18.52	9	6.56 (5.42–7.67)	41	6.22 (5.30–6.89)	0.26
RASSF1A	6.93	17	1.23 (1.18–1.45)	31	1.26 (1.16–1.45)	0.78
ESR1	6.92	4	3.37 (2.88–3.57)	46	2.36 (1.99–2.67)	0.02
管理時(shí)間	6.68	5	1.17 (1.15–1.24)	45	1.22 (1.09–1.47)	0.74
DAPK	5.20	8	2.74 (2.33–3.23)	25	2.52 (2.07–3.11)	0.95

a IQR = 四分位距
來自 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)的 b p 值
最后，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組評估了基因甲基化的臨床和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(表 5)。組織學(xué)和性別都與CDH13的高甲基化有關(guān)，這在女性和腺癌患者中更常見。此外，分期與MGMT的高甲基化有關(guān)；第四階段疾病的患者在MGMT時(shí)更有可能發(fā)生高甲基化。

表 5:患者和腫瘤特征及抑癌基因甲基化

多變的	CDH13 高甲基化		RASSFA1 高甲基化		MGMT 高甲基化		DAPK 高甲基化		ESR1 高甲基化
多變的	是的	不	是的	不	是的	不	是的	不	是的	不

性別
男性	5 (11.4)	39 (88.6)	15 (34.9)	28 (65.1)	6 (13.6)	38 (86.4)	8 (20.5)	31 (79.5)	3 (6.8)	41 (93.2)
女性	6 (28.6)	15 (71.4)	8 (38.1)	13 (61.9)	2 (9.5)	19 (90.5)	4 (26.7)	11 (73.3)	3 (14.3)	18 (85.7)
p 值	0.15		0.99		0.99		0.72		0.38

組織學(xué)
鱗狀細(xì)胞癌	1 (2.9)	34 (97.1)	12 (35.3)	22 (64.7)	6 (17.1)	29 (82.9)	7 (24.1)	22 (75.9)	2 (5.7)	33 (94.3)
腺癌	8 (40.0)	12 (60.0)	9 (45.0)	11 (55.0)	2 (10.0)	18 (90.0)	4 (22.2)	14 (77.8)	4 (20.0)	16 (80.0)
其他	2 (20.0)	8 (80.0)	2 (20.0)	8 (80.0)	0 (0.0)	10 (100.0)	1 (14.3)	6 (85.7)	0 (0.0)	10 (100.0)
p 值	<0.001		0.40		0.40		0.99		0.18

腫瘤等級
<2	4 (19.0)	17 (81.0)	7 (33.3)	14 (66.7)	4 (19.0)	17 (81.0)	6 (35.3)	11 (64.7)	2 (9.5)	19 (90.5)
2	2 (8.7)	21 (91.3)	8 (36.4)	14 (63.6)	2 (8.7)	21 (91.3)	3 (15.8)	16 (84.2)	3 (13.0)	20 (87.0)
>2	4 (21.1)	15 (78.9)	8 (42.1)	11 (57.9)	2 (10.5)	17 (89.5)	3 (17.6)	14 (82.4)	1 (5.3)	18 (94.7)
p 值	0.47		0.90		0.64		0.36		0.87

臨床階段
我	1 (6.3)	15 (93.8)	6 (37.5)	10 (62.5)	2 (12.5)	14 (87.5)	3 (23.1)	10 (76.9)	1 (6.3)	15 (93.8)
二	6 (24.0)	19 (76.0)	9 (37.5)	15 (62.5)	5 (20.0)	20 (80.0)	7 (31.8)	15 (68.2)	3 (12.0)	22 (88.0)
三	3 (15.8)	16 (84.2)	7 (36.8)	12 (63.2)	0 (0.0)	19 (100.0)	2 (13.3)	13(86.7)	2 (10.5)	17 (89.5)
四	0 (0.0)	4 (100.0)	1 (25.0)	3 (75.0)	1 (25.0)	3 (75.0)	0 (0.0)	3 (100.0)	0 (0.0)	4 (100.0)
p 值	0.47		0.99		0.11		0.52		0.99

吸煙狀況
以前/從不	2 (16.7)	10 (83.3)	4 (33.3)	8 (66.7)	1 (8.3)	11 (91.7)	1 (9.1)	10 (90.9)	1 (8.3)	11 (91.7)
當(dāng)前的	9 (17.3)	43 (82.7)	19 (3??7.3)	32 (62.7)	7 (13.5)	45 (86.5)	11 (26.2)	31 (73.8)	5 (9.6)	47 (90.4)
p 值	0.99		0.99		0.99		0.42		0.99

包年吸煙
< 40	2 (11.1)	16 (88.9)	8 (44.4)	10 (55.6)	2 (11.1)	16 (88.9)	2 (14.3)	12 (85.7)	0 (0.0)	18 (100.0)
40–70	7 (21.2)	26 (78.8)	13 (39.4)	20 (60.6)	5 (15.2)	28 (84.8)	8 (26.7)	22 (73.3)	5 (15.2)	28 (84.8)
>70	1 (8.3)	11 (91.7)	2 (18.2)	9 (81.8)	1 (8.3)	11 (91.7)	2 (25.0)	6 (75.0)	1 (8.3)	11 (91.7)
p 值	0.53		0.34		0.99		0.66		0.40

年齡
<55	4 (26.7)	11 (73.3)	6 (40.0)	9 (60.0)	3 (20.0)	12 (80.0)	3 (25.0)	9 (75.0)	1 (6.7)	14 (93.3)
55–59	4 (18.2)	18 (81.8)	6 (28.6)	15 (71.4)	3 (13.6)	19 (86.4)	4 (20.0)	16 (80.0)	2 (9.1)	20 (90.9)
60–64	1 (6.7)	14 (93.3)	5 (33.3)	10 (66.7)	1 (6.7)	14 (93.3)	2 (18.2)	9 (81.8)	2 (13.3)	13 (86.7)
≥65	2 (15.4)	11 (84.6)	6 (46.2)	7 (53.8)	1 (7.7)	12 (92.3)	3 (27.3)	8 (72.7)	1 (7.7)	12 (92.3)
p 值	0.54		0.76		0.73		0.97		0.99

a從 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)得出的所有 p 值

討論

在這個(gè)基于歐洲的非小細(xì)胞肺癌病例系列中，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組評估了 DNA 甲基化變化對肺部腫瘤的特異性，并研究了這些變化是否可以在患者的血液中檢測到。在甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的 5 基因組中，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組觀察到與匹配的正常組織相比，肺腫瘤中的三個(gè)基因顯著高甲基化，但是，在患者的血液樣本中無法檢測到這些變化。相比之下，與正常樣本相比，在腫瘤中未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的一個(gè)基因在腫瘤樣本中具有高甲基化的個(gè)體的血液中確實(shí)具有更高的甲基化水平。這種關(guān)聯(lián)應(yīng)該在更大的研究中得到證實(shí)。
幾項(xiàng)研究調(diào)查了肺癌中選定基因中 DNA 甲基化的臨床相關(guān)性。有趣的是，該文獻(xiàn)的大部分使用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)( PCR )作為啟動子甲基化水平的量化方法。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組不知道有任何研究直接將該方法與甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組用于分析相同甲基化位點(diǎn)的亞硫酸氫鹽焦磷酸測序方法進(jìn)行比較，因此無法解決甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究與以前的研究相比的任何差異是否可歸因于使用的方法。然而，亞硫酸氫鹽焦磷酸測序被認(rèn)為是一種敏感的方法，可以檢測低拷貝數(shù)(即血液中循環(huán)腫瘤DNA的存在)。
之所以選擇這五個(gè)基因，是因?yàn)橹坝袌?bào)道稱它們在肺腫瘤中是高甲基化的。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的結(jié)果與這些發(fā)現(xiàn)并不有效一致，因?yàn)榕c鄰近的正常肺組織相比，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組未能觀察到NSCLC 中ESR1和MGMT的高甲基化。差異可能歸因于所用分析方法和高甲基化狀態(tài)解釋的差異，以及所研究的不同 CpG 位點(diǎn)。這強(qiáng)調(diào)了報(bào)告在確定甲基化狀態(tài)時(shí)正在分析哪些甲基化位點(diǎn)的重要性，并且有人建議此類報(bào)告將有助于比較在不同研究中獲得的基因特異性甲基化數(shù)據(jù)。對這些發(fā)現(xiàn)不一致的另一種可能的解釋可能是在甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的腫瘤系列中這兩個(gè)基因的啟動子中觀察到的甲基化水平非常低，從而避免了對相鄰正常肺組織中甲基化差異的檢測。
眾所周知，由于腫瘤細(xì)胞的裂解，可以在癌癥患者的血液(血清或血漿)中大量檢測到雙鏈 DNA 片段。因此，可以檢測患者外周血中的腫瘤特異性 DNA 改變，并且已經(jīng)證明它們可以作為中國人群中 NSCLC 檢測的生物標(biāo)志物。具體來說，張等人。確定了一組5個(gè)基因作為NSCLC早期診斷的標(biāo)志物，其中包括RASS1A和CDH13。因此，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組研究了在腫瘤中觀察到的三個(gè)基因的高甲基化是否也存在于血液中，但無法檢測到血液中升高的 DNA 甲基化。這可能是由于甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組血液樣本的所有 CpG 位點(diǎn)的甲基化水平始終較低。在三個(gè)基因的啟動子區(qū)域中選擇不同的甲基化位點(diǎn)將在血液樣本中產(chǎn)生更強(qiáng)的甲基化信號仍然是合理的，但鑒于甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組使用基因內(nèi)所有 CpG 位點(diǎn)的平均甲基化值，這不太可能?；蛘?，循環(huán)中存在的腫瘤 DNA 水平可能很低，導(dǎo)致基因特異性甲基化信號低。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組研究的局限性在于它不包括健康對照。因此，與來自 NSCLC 患者的血樣相比，來自健康對照的血樣中甲基化的差異仍然是合理的，這將揭示 NSCLC 篩查的一個(gè)有價(jià)值的目標(biāo)。盡管存在這種限制，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的結(jié)果因此表明這些不是甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組人群中早期篩查 NSCLC 的合適目標(biāo)。
甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組還研究了異常甲基化與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究結(jié)果表明，某些基因的甲基化可能與患者的某些臨床病理學(xué)特征有關(guān)。啟動子和組織病理學(xué)中多個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化比較表明，CDH13 的甲基化 (p<0.001) 在腺癌中更高。這與之前的報(bào)告形成對比，即高甲基化的流行在肺癌的主要組織學(xué)亞型之間無法區(qū)分。這種差異可能是由于暴露的差異和用于分析 DNA 甲基化的不同技術(shù)(10。另一方面，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究與報(bào)道的鱗狀細(xì)胞癌和腺癌甲基化模式的差異一致。這種組織學(xué)發(fā)現(xiàn)與Toyooka 及其同事的報(bào)告一致。
Vaissiere 等人的一項(xiàng)研究中的定量分析揭示了 RASSF1A 高甲基化與性別(男性表現(xiàn)出較高的甲基化水平)以及白金漢 (女性的 RASSF1A 甲基化水平較低)的相關(guān)性。在甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究中，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組發(fā)現(xiàn) RASSF1A 高甲基化與性別沒有關(guān)聯(lián)。差異可能反映了分析和解釋高甲基化狀態(tài)的不同方法以及所研究的不同 CpG 位點(diǎn) 。
盡管衰老與某些基因的甲基化有關(guān) ，但甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組沒有發(fā)現(xiàn)RASSF1A、CDH13、MGMT、ESR1和DAPK基因中腫瘤甲基化的總體比例與年齡之間存在相關(guān)性。缺乏關(guān)聯(lián)可能是由于甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究參與者的年齡范圍狹窄(最小和最大年齡組僅相差 10 歲)。
此外，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組發(fā)現(xiàn)甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組研究的任何基因的高甲基化與吸煙狀況都沒有關(guān)聯(lián)，因此需要進(jìn)一步的研究來闡明吸煙在吸煙者特定基因表觀遺傳失活中的作用。
總之，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組確認(rèn)RASSF1A、CDH13和DAPK的高甲基化在 NSCLC 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，但也表明這些基因不是甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組研究中納入的中歐高加索人早期檢測 NSCLC 的合適標(biāo)志物。因此，其他潛在的 NSCLC 表觀遺傳生物標(biāo)志物仍有待檢查，以確定那些可能用作肺癌篩查工具的標(biāo)志物。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的數(shù)據(jù)表明，肺癌中一些更常見的表觀遺傳變化可能并不適合這一目的，因此需要對更大的基因組進(jìn)行更多的研究。此外，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究揭示了特定基因中高甲基化與臨床病理學(xué)特征的一些有趣關(guān)聯(lián)。然而，由于規(guī)模限制，這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)被視為探索性的，并且仍有待在更大的隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。
???

臨床實(shí)踐要點(diǎn)

肺癌中的 DNA 甲基化變化已得到充分證實(shí)，將這些知識轉(zhuǎn)化為篩查具有顯著改善健康的潛力。隨著新的疾病篩查標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有可能實(shí)現(xiàn)早期診斷，為癌癥治療做出更明智的選擇，并確定與預(yù)后和治療反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物。
據(jù)報(bào)道，許多基因在肺腫瘤中異常甲基化。在這里，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組使用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序研究了一組五個(gè)基因(RASSF1A、CDH13、MGMT、ESR1 和 DAPK)，以確定這些甲基化變化是否對肺腫瘤具有特異性，并測試這些變化是否可以在患者的血液樣本中檢測到。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組還分析了 DNA 甲基化與臨床病理學(xué)特征之間可能存在的關(guān)聯(lián)。
甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組觀察到與匹配的正常組織相比，肺腫瘤中的三個(gè)基因顯著高甲基化，但是，在患者的血液樣本中無法檢測到這些變化。甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組證實(shí)了 RASSF1A、CDH13 和 DAPK 的高甲基化在 NSCLC 發(fā)病機(jī)制中起作用，但也表明這些基因不適合在甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組研究的中歐高加索人中早期檢測 NSCLC。因此，其他潛在的 NSCLC 表觀遺傳生物標(biāo)志物仍有待檢查，以確定那些可能用作肺癌篩查工具的標(biāo)志物。
此外，甲基化基因檢測在肺癌中的應(yīng)用課題組的研究揭示了特定基因中高甲基化與臨床病理學(xué)特征的一些有趣關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)仍有待在更大的隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。

Aberrant promoter methylation of CDH13 and MGMT genes is associated with clinicopathologic characteristics of primary non-small-cell lung carcinoma.
Kontic M, Stojsic J, Jovanovic D, Bunjevacki V, Ognjanovic S, Kuriger J, Puumala S, Nelson HH.
Clin Lung Cancer. 2012 Jul;13(4):297-303. doi: 10.1016/j.cllc.2011.11.003. Epub 2011 Dec 13.
PMID: 22169480

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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