【佳學(xué)基因-基因檢測(cè)】實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介與應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR，英文全稱是Real Time Flurocent Qualitative PCR,簡(jiǎn)稱RT-QPCR,或者更簡(jiǎn)潔地稱之為Q-PCR 或者是RT-PCR 是1996 年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域， 不僅涉及到對(duì)DNA的定量， 核酸多態(tài)性分析， 基因突變分析等，同時(shí)對(duì)染色體病的診斷、基因病的診斷、腫瘤研究以及用藥評(píng)估方面都有廣泛應(yīng)用。腫瘤基因檢測(cè)哪里做？

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，例如特異性好、正確性高、靈敏度高、可定量檢測(cè)、 誤差小、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、交叉污染和污染環(huán)境機(jī)會(huì)少等。 同時(shí)因不需雜交、電泳、凝膠成像,在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過程中就可以真實(shí)地展現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在動(dòng)物檢疫和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面也得到了廣泛的應(yīng)用， 使人們的健康得到保障， 同時(shí)， 也可使人們深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化過程。腫瘤基因檢測(cè)哪里做？

熒光定量PCR，（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通過在PCR管中、96孔板或者是384孔板的微型小孔中加入能夠指示反映進(jìn)程的熒光探染料或者探針，對(duì)反應(yīng)的過程中通過代表反映產(chǎn)物的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來快速直觀地知道待測(cè)DNA的量。可以通過信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間、出現(xiàn)的位置來進(jìn)行相對(duì)定量。如果設(shè)置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，還可以進(jìn)行先進(jìn)定量。

同PCR設(shè)計(jì)時(shí)的三溫度反應(yīng)法，qPCR技術(shù)的全部反應(yīng)過程在一個(gè)可以進(jìn)行良好控制的環(huán)境中進(jìn)行，降低了污染概率，并且可以通過對(duì)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)從而進(jìn)行定量檢測(cè)，因此臨床應(yīng)用賊為廣泛，已成為PCR中的主導(dǎo)技術(shù)。

所使用的熒光物質(zhì)可分為：TaqMan熒光探針、分子信標(biāo)和熒光染料。

1)TaqMan熒光探針：

擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)由于距離很近被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，消除淬滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的熒光吸收效應(yīng)，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成有效同步。

2)SYBR熒光染料：

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而高效熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加有效同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 包括探針類和染料類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加， 染料類如SYBR Green I 則是利用與雙鏈DNA 小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加對(duì)病原DNA 的檢測(cè)。Taqman探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用taq酶的3’-5’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針和模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。

針對(duì)遺傳病的基因突變，設(shè)計(jì)跨越突變位點(diǎn)的熒光探針，對(duì)跨越突變位點(diǎn)的一段基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱以獲得熔解曲線，根據(jù)熔解曲線判斷是否有基因突變。腫瘤基因檢測(cè)哪里做？

對(duì)某種基因型疾病實(shí)施藥物治療后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)相關(guān)基因是否轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄量的多少均可以快速正確的監(jiān)控，對(duì)臨床有重要指導(dǎo)意義。

癌基因的表達(dá)增加和突變?cè)谠S多腫瘤早期和良性階段就會(huì)出現(xiàn)， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR不但能有效地檢測(cè)基因的突變，而且能正確測(cè)定表達(dá)量，據(jù)此可進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。
 

3)分子信標(biāo)

是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。

PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。

第二代PCR主要缺點(diǎn)：

靈敏度還有欠缺，低拷貝標(biāo)本檢測(cè)不正確。

存在背景值影響，結(jié)果易受干擾。

當(dāng)反應(yīng)體系中有PCR抑制物時(shí)，檢測(cè)結(jié)果易受干擾。