【佳學(xué)基因檢測(cè)】分子診斷與基因檢測(cè)中的DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

分子診斷與基因檢測(cè)兩個(gè)重要考核指標(biāo)是檢測(cè)的靈敏性和特異性。PCR是使用賊為廣泛的DNA、RNA序列復(fù)制技術(shù)，以其靈敏性、特異性得到廣泛應(yīng)用，然而PCR需要反復(fù)的熱變性，無法擺脫依賴儀器設(shè)備的局限，從而限制了其在臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。

自20世紀(jì)90年代初，很多實(shí)驗(yàn)室開始發(fā)展無需熱變性的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，現(xiàn)已開發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等技術(shù)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本榮研公司的Notomi等于2000年首先提出來的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。

基于該技術(shù)，榮研還曾和國內(nèi)某公司引起專利糾紛。

其擴(kuò)增原理是基于DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。

DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。

先確定目標(biāo)基因上的6個(gè)特異性區(qū)域F3、F2、F1、B1、B2、B3，然后依據(jù)這6 個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物（如下圖）：

正向內(nèi)引物(forwardinner primer，F(xiàn)IP)，由F1c 和F2 組成。

反向內(nèi)引物(backwardinner primer，BIP)，由B1c 和B2 組成，中間均以TTTT作為間隔。

外引物F3、B3 分別由目的基因上的F3、B3 區(qū)域組成。

在LAMP 反應(yīng)體系中，內(nèi)引物的濃度幾倍于外引物的濃度。內(nèi)引物先與模板鏈結(jié)合合成互補(bǔ)鏈，形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結(jié)合，形成DNA雙鏈，在BstDNA 聚合酶的作用下，釋放出由內(nèi)引物合成的互補(bǔ)鏈，該互補(bǔ)鏈經(jīng)過一系列反應(yīng)賊終形成具有啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA單鏈。

以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，由內(nèi)外引物引導(dǎo)過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng)，賊后形成具有多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度不一的DNA混合物。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足

LAMP 的優(yōu)勢(shì)：

（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10個(gè)拷貝的目的基因，擴(kuò)增效率為普通PCR的10 倍-100 倍。

（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。

LAMP 的不足：

（1）對(duì)引物的要求特別高。

（2）擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆測(cè)序，只能用于判斷。

（3）由于其敏感性強(qiáng)，容易形成氣溶膠，造成假陽性，影響檢測(cè)結(jié)果。

鏈置換擴(kuò)增

鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification,SDA）是美國學(xué)者Walker于1992年新穎提出的一種基于酶促反應(yīng)的DNA體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對(duì)引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。

鏈置換擴(kuò)增其原理是基于在靶DNA兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將鏈DNA打開缺口，DNA聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。

被替換下來的DNA單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復(fù)進(jìn)行，使靶序列被高效擴(kuò)增。

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鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與不足

SDA 的優(yōu)點(diǎn)：

擴(kuò)增效率高，反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。

SDA 的不足：

產(chǎn)物不均一，在SDA循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物，用電泳法檢測(cè)時(shí)必然會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

滾環(huán)核酸擴(kuò)增

滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling circle amplification, RCA）是通過借鑒病原生物體滾環(huán)復(fù)制DNA的方式而提出的，指在恒溫下以單鏈環(huán)狀DNA為模板，在特殊的DNA聚合酶（比如Phi29）的作用下，進(jìn)行滾環(huán)式DNA合成，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的擴(kuò)增。

RCA可分為線性擴(kuò)增與指數(shù)擴(kuò)增兩種形式，線性RCA的效率可達(dá)到105倍，而指數(shù)RCA的效率可達(dá)到109倍。

簡(jiǎn)單區(qū)分，如下圖，線性擴(kuò)增a只用1條引物，指數(shù)擴(kuò)增b則有2條引物。

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線性RCA 又稱為單引物RCA，一條引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物為單環(huán)長(zhǎng)度數(shù)千倍的大量重復(fù)序列的線狀單鏈。

由于線性RCA的產(chǎn)物始終連接在起始引物上，所以信號(hào)易于固定是它的一大優(yōu)勢(shì)。

指數(shù)RCA，也被稱作超分支擴(kuò)增HRCA(Hyper branched RCA)，在指數(shù)RCA中，一條引物擴(kuò)增出RCA產(chǎn)物，第二條引物與RCA產(chǎn)物雜化并延伸，置換已經(jīng)結(jié)合在RCA產(chǎn)物上的下游引物延伸鏈，反復(fù)進(jìn)行延伸和置換，產(chǎn)生樹狀的RCA擴(kuò)增產(chǎn)物。

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以4BaseBio公司的TruePrime滾環(huán)擴(kuò)增試劑盒為例，使用TthPrimPol引物酶和Phi29DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)了無需添加引物即可進(jìn)行擴(kuò)增。

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滾環(huán)核酸擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足

RCA 的優(yōu)勢(shì)：

靈敏度高，特異性好，易操作。

RCA 的不足：

信號(hào)檢測(cè)時(shí)的背景問題。在RCA反應(yīng)過程中未成環(huán)的鎖式探針和未結(jié)合探針的模板DNA或者RNA 可能產(chǎn)生一些背景信號(hào)。

依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)

依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（nucleicacid sequence-based amplification, NASBA）是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，是由1對(duì)帶有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以在2h左右將模板RNA擴(kuò)增約109倍，比常規(guī)PCR法高1000倍，不需特殊的儀器。

該技術(shù)一出現(xiàn)就被用于疾病的快速診斷，目前有不少公司的RNA檢測(cè)試劑盒都用此方法。

盡管RNA的擴(kuò)增也可以使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，NASBA相比則有自己的優(yōu)勢(shì)：可以在相對(duì)恒溫的條件下進(jìn)行，相對(duì)傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更為穩(wěn)定、正確。

反應(yīng)在41攝氏度下，需要AMV（avian myeloblastosis virus）逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對(duì)引物來完成。

其過程主要包括：

正向引物包含T7啟動(dòng)子互補(bǔ)序列，反應(yīng)過程中正向引物與RNA鏈結(jié)合，由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈。

RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈。

在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動(dòng)子序列的DNA雙鏈。

在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉(zhuǎn)錄過程，產(chǎn)生大量目的RNA。

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NASBA的優(yōu)勢(shì)：

（1）它的引物上帶有T7啟動(dòng)子序列，而外來雙鏈DNA無T7啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，因此該技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度。

（2）NASBA將反轉(zhuǎn)錄過程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，縮短了反應(yīng)時(shí)間。

NASBA的劣勢(shì)：

（1）反應(yīng)成分比較復(fù)雜。

（2）需要3種酶使得反應(yīng)成本較高。