【佳學(xué)基因檢測】如何設(shè)計并進行西妥昔和avelumab 治療非小細胞肺癌的基因檢測臨床實驗？

 

基因檢測臨床實驗中外周血單個核細胞 (PBMC) 分離和乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放細胞毒性測定

參照《人類遺傳病基因檢測技術(shù)大全》，在 CAVE-Lung 試驗患者中連續(xù)獲得PBMC，在西妥昔單抗加 avelumab 治療期間進行，并評估 LDH 釋放細胞毒性試驗。

 

下一代測序 (NGS)基因檢測方法

在 CAVE-Lung 試驗患者入組時收集血漿樣本，作為腫瘤基因組分析的循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 的來源。 NGS 分析使用佳學(xué)基因腫瘤致病基因鑒定基因解碼基因檢測平臺進行。使用 QIAmp DNA Blood Midi Kit (cod#51183) 從 PBMC 中提取基因組種系 DNA。按照試劑盒的操作指南，使用 Agilent SureSelect 人全外顯子試劑盒 (Agilent) 生成測序文庫，并在 NexSeq 平臺 (Illumina) 上進行測序。使用 Burrow-Wheeler Aligner 將測序數(shù)據(jù)與人類參考 GRCh37/hg19進行比對。 SNV 和插入缺失根據(jù)佳學(xué)基因質(zhì)量控制標準進行獲取，這些標準包括：低復(fù)雜性、重復(fù)區(qū)域和片段重復(fù)被過濾掉；質(zhì)量得分 ≥ 20，深度 ≥ 10，雜合子標準AB≥0.2；數(shù)據(jù)獲取率 ≥ 0,85。在獲得基因突變位點后，通過應(yīng)用三個過濾步驟強化罕見突變的獲得：I）gnomAD 中 MAF 為 1% 的基因突變； II) 基因突變類別，包括錯義、蛋白質(zhì)截斷和調(diào)節(jié)；突變效應(yīng)，變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)截斷，并被預(yù)測工具（SIFT、POLYPHEN-2、MUTATIONTASTER、MutationAssessor、FATHMM 和 FATHMM-MKL）預(yù)測為有害； iii) InterVar 和 ClinVar 數(shù)據(jù)庫中分類為致病性、可能致病性或 VUS 的基因突變。詳細信息請參閱佳學(xué)基因其他基因檢測技術(shù)文章。

腫瘤靶向用藥基因解碼基因檢測中如何應(yīng)用流式細胞儀分析

對于流式細胞術(shù)（熒光相關(guān)細胞分選，F(xiàn)ACS）分析，PBMC 用染色緩沖液（SB）（2% 胎牛血清，F(xiàn)BS，磷酸鹽緩沖鹽水中的 0.1% 疊氮化鈉）中洗滌，并在封閉染色緩沖液加20%封閉血清中封閉10分鐘后，用以下單克隆抗體染色 30 分鐘：抗 CD107a、抗 TIM-3 和抗 PD-L1（Miltenyi Biotec）。將染色的細胞洗滌兩次，重新懸浮在染色緩沖液中，使用 FACS ACCURI C6 上使用 ACCURI C6 軟件（BD Biosciences）獲得細胞表面抗體的表達數(shù)據(jù)。

腫瘤基因解碼時如何用來自患者腫瘤樣本進行體外三維 (3D) 培養(yǎng)物的活力測定

根據(jù)《腫瘤致病基因鑒定基因解碼及基因檢測技術(shù)實驗指南》，從 3 名 NSCLC 患者腫瘤樣本中分離離體 3D 培養(yǎng)物。將所得腫瘤球體以 1 × 1000 個細胞/孔的密度接種在 96 孔板中，并用指定的藥物進行處理。根據(jù)檢測試劑盒的使用說明，使用 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) Assay Kit (Abcam) 測量細胞增殖和細胞毒性。 MTS 測定方案基于 MTS 四唑化合物被活細胞還原以產(chǎn)生可溶于細胞培養(yǎng)基的有色甲臜染料。通過測量 490–500nm 處的吸光度來量化甲臜染料。

定量實時聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)

關(guān)于如何采用定量實時 PCR進行基因檢測。根據(jù)《基因檢測實驗室操作指南》進行總 RNA 提取和 RT-qPCR（實時定量 PCR）。根據(jù)所要檢測的序列設(shè)計引物序列。為了計算相對基因表達值，使用 2-ΔCt 或 2-ΔΔCt 方法。通過解離曲線分析和使用非模板對照排除了由引物二聚體引起的非特異性信號。

 

TCGA 數(shù)據(jù)庫的基因表達分析

癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)集包括 511 例肺腺癌和 501 例肺鱗癌，以及轉(zhuǎn)錄組和基因組圖譜的可用數(shù)據(jù)。

 

統(tǒng)計分析

使用 Graphpad Prism 軟件 V.6.0（Graphpad Software，San Diego，California，USA）進行統(tǒng)計分析。

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