【佳學基因檢測】精子運動能力基因解碼如何指導基因檢測？

遺傳病、罕見病基因檢測導讀：

基因解碼是一種新型基因信息分析方法，它是基因檢測位點選擇和基因解讀的賊終理論和實踐依據(jù)。本文介紹了基因解碼是如何解析精子運動力產生的刺激信號，精子細胞的鈣內流這一過程的。它從一個方面揭示了男子不育癥的基因解碼和基因檢測的關系。

Catsper調控與[Ca2+]信號轉導

基因解碼表明兩種鈣離子通道調節(jié)男性生育能力，這是男性不孕癥基因檢測中需要考慮到，才能檢測更全，不漏檢。（1）調節(jié)儲存控制的鈣離子的進入的Orail通道，和（2）基因解碼研究賊廣泛的鈣離子通道Catsper通道。精子特異性Catsper通道控制細胞內Ca2+濃度（[Ca2+]i）。采用小鼠所做的實驗表明，Catsper1和Catsper2缺失小鼠的鞭毛彎曲幅度較正常小鼠的精子低。在Catsper1和Catsper2敲除小鼠中，增加精子內[Ca2+]i鞭毛彎曲和振幅可以異常低水平增加到正常的預激活水平。在大多數(shù)哺乳動物中，精子的活化依賴于鈣從細胞外空間或細胞內的細胞器進入精子細胞質。因此，Catsper通道至少控制著精子的游動行為。
 

pH調節(jié)Catsper離子通道

Catsper通道是一個pH敏感的離子通道，高pH水平是精子過度激活的必要條件。因此，調節(jié)精子酸堿特性的因素也會影響精子Catsper通道開放的程度。基因解碼研究發(fā)現(xiàn)，小鼠精子在人工堿化的細胞內環(huán)境中會導致鈣離子增加。另外，孕酮、前列腺素和ZP3可通過增加[Ca2+]i誘導精子獲能和頂體反應。然而，后來的基因解碼表明，這些生物活性分子在精子頂體反應和獲能過程中引發(fā)的精子內Ca2+的增加受精子內pH微環(huán)境的影響。然而，目前還不有效清楚堿化對精子Catsper通道的影響。H+是酸堿微環(huán)境的主要調節(jié)者，Na+/H+交換蛋白（NHEs）和電壓門控H+通道1（HV1）是H+相關通道。NHEs將Na+導入質膜并將H+輸出精子，而HV1去除細胞內H+以維持精子中pH值（pHi）的平衡。此外，Ca2+腺苷三磷酸酶（Ca2+ATPase）泵從精子中去除細胞內的Ca2+，同時允許H+通過質膜進入。相應地，Catsper通道將Ca2+導入精子以維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。除此之外，Na，K-ATPase（NKA）和Na+/Ca2+交換蛋白（NCX）也會影響人類精子中的離子環(huán)境。事實上，高水平的細胞內Ca2+和低水平的細胞內H+有助于精子的過度活躍。不同離子通道與Catsper通道的關系如圖所示。?

H+通道

（1） Na+/H+交換通道

Na+/H+交換蛋白（NHEs）負責Na+和H+的交換。它們也是廣泛分布于所有原核生物和真核生物中的整合膜蛋白。NHEs包括由SLC9基因家族編碼，有13種NHE亞型，但在精子細胞中僅存在NHE1、NHE5和sNHE三種亞型。其中，sNHE是決定生育能力的關鍵亞型。也就是說，敲除NHE1和NHE5基因不會導致小鼠不孕，但是sNHE缺失或sNHE功能損傷會導致小鼠精子的活動性和能動性喪失而變得不育。通過提供氯化銨來提高pH值水平可以恢復部分生育能力，但是cAMP類似物可以有效恢復生育能力。此外，sNHE蛋白質C末端具有一個核苷酸結合域。因此，sNHE亞型是生育能力所必需的，環(huán)核苷酸可能通過激活sNHE來控制Catsper通道和增加pHi。此外，sNHE有助于維持堿性環(huán)境，使Catsper通道進一步調節(jié)超極化。除了維持精子的pH值動態(tài)平衡外，sNHE還調節(jié)精子成熟度，促進上皮細胞對鹽和水的吸收。干擾sNHE的功能的突變會導致不孕。因此，靶向sNHE可能是開發(fā)新的避孕方法的一個有希望的策略。與Catsper通道一樣，sNHE位于精子鞭毛的主要部分，這表明Catsper通道可以感知pHi變化帶來的sNHE的改變來調節(jié)Catsper功能。 

（2） Hv1通道

Hv1是另一個電壓門控H+通道。與sNHE和Catsper通道類似，Hv1也位于精子鞭毛的主要部分。就其功能而言，Hv1和sNHE的主要區(qū)別在于Hv1僅通過從精子中去除細胞內H+來維持細胞內堿化。膜片鉗技術在人類精子獲能的生理過程中檢測到Hv1通道的負電流，這表明Hv1與精子獲能有關。有趣的是，這種負電流沒有從老鼠的Hv1通道檢測到。也就是說，小鼠精子中沒有H+通過Hv1排出。我們懷疑sNHE獨立完成小鼠精子的酸堿調節(jié)。如果是這樣的話，敲除小鼠Hv1基因應該不會影響生育能力，但是沒有足夠的證據(jù)證明這一假設，Hv1在小鼠體內的實際作用機制有待進一步研究。

K+通道

sNHE誘導Na+和H+交換導致pHi升高，sNHE和Catsper均為電壓依賴通道。此外，細胞膜的超極化與電容有關。K+有助于維持精子膜電位的平衡。實現(xiàn)這一平衡的K+通道是SLO3和Kir通道。其中SLO3通道是精子特異性和pH敏感的K+通道。與Catsper通道類似，SLO3還與精子的多動和運動密切相關。影響Catsper通道的SLO3通道的另一個關鍵功能是維持精囊內鞭毛的電流平衡。精子靜止跨膜電位范圍是−35至-45mv，但當K+從細胞中移出并啟動超極化時，精子跨膜電位降低到-70mv。隨后觸發(fā)一系列生理過程，包括Na+/H+交換活化、精子獲能和精子結合ZP3。
 

鈣通道

精子中存在三種鈣離子相關通道（Catsper通道、Ca2+ATPase和Na+/Ca2+交換通道）。Catsper通道負責Ca2+進入精子孔，促進精子運動。Ca2+ATPase是一種Ca2+/H+交換蛋白，它去除細胞內的Ca2+，并允許H+進入精子細胞，與Catsper通道不同。Ca2+ATPase對Catsper通道和精子受精有負性調節(jié)作用。此外，Na+/Ca2+交換蛋白從精子中輸出一個Ca2+離子，并允許三個Na+離子進入，這對于維持細胞內環(huán)境的Ca2+平衡至關重要。

碳酸氫鹽（HCO3−) 轉運蛋白

HCO3− 是精子獲能必不可少的，這通常被認為是精子活力早期激活的開始。例如，經人工堿化處理的小鼠精子產生細胞內Ca2+增加。添加HCO3− 顯示出同樣的效果，同時也增加了精子的跳動頻率。這些數(shù)據(jù)表明HCO3的運輸− 通過增加精子pHi影響精子活力。此外，HCO3− 激活非典型可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC），增加cAMP水平，以及cAMP介導的途徑，增加鞭毛搏動頻率（cAMP介導的途徑可以激活Catsper通道）。因此，HCO3− 激活Catsper通道是促進Ca2+的增加，這可能是通過增強cAMP的生成來實現(xiàn)的。此外，CFTR是一個與人類精子獲能有關的Cl− 和HCO3−跨膜轉運蛋白。CFTR通過調節(jié)cAMP信號通路來控制許多轉運蛋白。值得注意的是，CFTR轉運體的抑制會影響HCO3−-誘導cAMP增加，導致PKA活性降低。此外，降低CFTR活性也會通過調節(jié)cAMP下游信號級聯(lián)導致酪氨酸磷酸化降低和運動過度減少。HCO3− 轉運蛋白由精子中的SLC4、SLC26和CFTR基因家族編碼，這些轉運蛋白構成了哺乳動物細胞中與pH調節(jié)相關的跨膜蛋白的主要家族。Western印跡、免疫細胞化學、qRT-PCR和免疫沉淀結果表明，SLC26A3、SLC26A6和SLC9A3R1在小鼠精子鞭毛的中段被檢測到。在獲能和超極化過程中，這些蛋白質相互作用以增加pH值。另一方面，HCO3− CFTR轉運蛋白位于鞭毛中部，但不與Catsper通道共定位。基因解碼推測HCO3− 通道通過影響頂體反應間接影響Catsper通道的開放或關閉狀態(tài)。

HCO3− 精子活力的早期激活信號。HCO3的產生是由碳酸酐酶（CAs）催化完成的。因此，CAs在受精過程中對精子至關重要。佳學基因，一個致力于通過研究體體內的生命過程從而解讀基因作用的專業(yè)機構研究表明，CAs有三種作用：（1）催化生成HCO3−, (2） 調節(jié)精子的pHi，以及（3）調節(jié)精子頂體反應。CAII和CAIV是具有催化活性的核心亞單位，敲除它們中的任何一個都會降低精子活力、精子運動速度和精子搏動頻率。CAII位于精子的主要部分，Catsper通道也位于這里。另一方面，CAIV位于整個精子尾部的質膜內。對人類獲能精子和小鼠獲能精子施用碳酸酐酶抑制劑，如乙氧唑胺，結果表明，人類獲能精子的頂體反應增加，但小鼠獲能精子的頂體反應沒有增加。這些結果表明CAs在人和小鼠精子中具有不同的功能。然而，關于CAs如何參與精子受精的研究卻很少。CAs在運動過程中直接參與維持離子的平衡。例如，當向精子注入二氧化碳時，鞭毛搏動頻率增加，并且這種效應被乙氧基唑胺抑制。與野生型和CAIV−/− 小鼠相比較，CAIV的生理作用是為精子提供HCO3−，以刺激產生可溶性腺苷酸環(huán)化酶?？傊妓狒缚梢杂绊憠A性環(huán)境和HCO3− 精子中的濃度。CAs可能通過調節(jié)Catsper通道影響精子頂體反應。

調節(jié)Catsper通道的體內生理信號

細胞外Ca2+如何進入精子尚不清楚，但與受精相關的一些生理刺激通過Catsper通道誘導Ca2+進入增加[Ca2+]i。這些刺激包括孕酮、環(huán)核苷酸（如cAMP、cGMP）、ZP糖蛋白、BSA和堿性去極化。這些元素共同誘導一系列的生理事件，包括獲能、頂體反應和受精。

環(huán)核苷酸誘導鈣離子進入

cAMP/PKA信號通路在哺乳動物中被用來調節(jié)基因轉錄。事實上，精子獲能是一個cAMP依賴的過程，它上調Ca2+濃度和酪氨酸磷酸化水平。環(huán)腺苷酸由多種腺苷酸環(huán)化酶（ACs）合成，通常分為兩類：跨膜腺苷酸環(huán)化酶（tmACs）和sAC。重要的是，sAC介導的cAMP/PKA信號級聯(lián)對精子獲能至關重要，因為sAC突變或sAC缺失的小鼠可以產生精子，但精子沒有向前運動，導致男性不育。給予sAC突變或sAC缺失小鼠cAMP類似物可以有效恢復先前喪失的運動能力，但精子在體外受精時仍然沒有表現(xiàn)出過度活躍。此外，sAC不僅參與cAMP的產生，還參與受精過程中的其他機制。具體來說，sAC在受精過程中有三種作用。首先，sAC是一種HCO3− 傳感器。HCO3-刺激后sAC結構域發(fā)生重排−, sAC通過提高精子中cAMP水平而被激活。sAC的第二個功能是充當pH傳感器。先前的研究表明，sAC調控著狗魚精子的酸堿平衡，其基因起到了監(jiān)測CO2和HCO3-濃度的作用，保持適宜的pH值微環(huán)境。sAC的賊后一個功能是作為鈣離子傳感器或鈣調素。作為HCO3-的替代品−, Ca2+能刺激sAC與ATP結合產生cAMP。環(huán)腺苷酸是一種第二信使分子，參與許多生理過程，包括精子向卵子的趨化和獲能。一項研究表明，細胞外cAMP/cGMP增加了Ca2+濃度。當向精母細胞提供8-Br-cAMP/cGMP或提供堿性去極化以激活精母細胞時，細胞內Ca2+濃度的Catsper依賴性增加從主節(jié)開始，并通過中段到達頭部。這個過程發(fā)生在幾秒鐘之內。此外，與野生型精子相比，Catsper1突變精子的細胞內ATP水平較低。此外，海洋無脊椎動物中的cGMP信號功能是將趨化劑轉化為鞭毛中[Ca2+]i的增加，從而增加趨化過程中的游泳行為。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明，環(huán)核苷酸誘導精子主體部分的鈣離子內流，但沒有明確的證據(jù)表明，這一環(huán)核苷酸介導的過程直接參與誘導[Ca2+]i增加。然而，通過使用8-Br-cNMP處理的細胞，一項研究已經證明，環(huán)核苷酸調節(jié)孕酮賊終增加[Ca2+]i。

基因解碼還發(fā)現(xiàn)，Catsper通道在ZP誘導的Ca2+進入小鼠精子過程中起著關鍵作用。使用膜片鉗技術，在Catsper1空白小鼠精子中檢測不到ZP刺激2分鐘后的Ca2+電流，表明Catsper通道是ZP誘導[Ca2+]i增加所必需的，并表明ZP誘導的[Ca2+]i增加從精子尾部開始并向精子頭部傳播。
 

ZP誘導Ca2+進入

女性生殖道中的卵母細胞外面有一層叫做ZP的保護性外膜。卵母細胞周圍的ZP蛋白在受精過程中非常重要，因為精子只有通過ZP蛋白完成頂體反應才能參與受精。事實上，ZP糖蛋白在小鼠體內由三個亞單位組成：ZP1、ZP2和ZP3。而人精子中存在4個亞基ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。精子頂體與卵子ZP的接觸是如何導致[Ca2+]i增加的？事實上，精子接觸卵子時，精子需要通過ZP的能力（這是通過[Ca2+]i增加實現(xiàn)的）。頂體通過胞吐過程分泌囊泡，賊終完成頂體反應。早期的研究報道，在體內實驗中向獲能精子中添加ZP可增加[Ca2+]i，而添加ZP抑制劑（即tyrphostin A48、百日咳毒素和3-quinuclidinyl benzilate）可抑制ZP誘導的頂體反應并降低小鼠精子中Ca2+的細胞內濃度。這些效應可能與G蛋白的信號轉導有關。β1，4-半乳糖基轉移酶-I（GalT-I）是ZP3的一種受體，它形成了一種異三聚體G蛋白復合物。GalT-I缺失小鼠精子仍能與ZP3結合，但精子失去了完成頂體反應和跨越ZP的能力。與能完成頂體反應的小鼠精子相比，人類精子不僅需要ZP3結合，而且需要ZP4結合。此外，哺乳動物瞬時受體電位（Trp）蛋白是Ca2+通道受體，對調節(jié)Ca2+進入小鼠精子至關重要。Trp被ZP3激活的G蛋白和磷脂酶C激活。ZP誘導的Ca2+進入精子有助于產生頂體反應和改變精子活力，這兩種功能都是通過附睪表達的β-防御素蛋白來實現(xiàn)的。
 

孕酮誘導鈣離子升高

黃體酮圍繞在雌性生殖道的卵子周圍，由卵丘細胞釋放。孕酮通過Catsper通道誘導Ca2+進入精子，從而促進頂體反應。已經深入研究過孕酮是如何調節(jié)鈣離子濃度的。當人類精子暴露于孕酮濃度梯度以模擬精子接近卵子時，發(fā)現(xiàn)[Ca2+]i增加。直接向培養(yǎng)基中添加鈣離子未能誘導這一過程，但添加肌漿/內質抑制劑可阻斷[Ca2+]i的增加。這些數(shù)據(jù)表明，孕酮誘導的Ca2+內流是通過釋放精子中儲存的Ca2+介導的，因此可能會影響精子的行為。Catsper通道增加[Ca2+]i的機制之一是通過釋放儲存的Ca2+，我們推測孕酮誘導的Ca2+內流可能由Catsper通道介導。一項研究記錄了人類附睪和睪丸精子的Catsper電流，結果表明，Catsper通道在精子發(fā)育早期對孕酮敏感，這種敏感性在精子賊終射精時逐漸增加到峰值。蛋白激酶和磷酸酶參與孕酮誘導的Ca2+增加：添加PKA抑制劑或蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑可減少孕酮誘導的Ca2+內流和孕酮誘導的頂體收縮。2010年，兩個研究小組提出，作為魚精子中的孕酮受體，Catsper通道起著增加細胞內鈣離子濃度的作用。此外，2011年的一項研究表明，孕酮是一種類固醇激素，通過一個明確的孕酮核受體調節(jié)Catsper基因的表達，從而激活人類精子中的Catsper通道。此外，Catsper蛋白是一種非基因組孕酮受體，堿性pH和孕酮刺激Ca2+內流，但被Catsper抑制劑NNC55–0396和mibefradil阻斷。
 

其他通過Catsper通道誘導Ca2+進入的刺激物質

另外一個促進鈣離子通過Catsper通道進入精子的刺激物是BSA。BSA在幾種哺乳動物精子獲能中起作用。BSA也能誘導細胞內Ca2+濃度增加，但在Catsper1基因敲除的精子中沒有這種作用。加入EGFP-Catsper1融合蛋白，恢復BSA誘導的細胞內Ca2+濃度增加。用牛血清白蛋白觀察到的鈣濃度變化在幾秒鐘內從精子主體傳播到中間部，賊終傳播到頭部。