【佳學(xué)基因檢測(cè)】眼科基因檢測(cè)明確 3 型 Usher 綜合征家庭的突變位點(diǎn)

眼科基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

Usher綜合征（USH）是一種嚴(yán)重的遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為聽(tīng)力和視力的雙重喪失。USH最早由蘇格蘭眼科醫(yī)生Charles Usher描述。據(jù)估計(jì)，先天性耳聾患者中USH的發(fā)病率約為3.5/100,000至16.6/100,000。該病是先天性重度或深度耳聾兒童的根本病因之一，占大約9.2%的病例。此外，USH僅次于Pendred綜合征，是最主要的綜合征性耳聾形式。

USH的主要臨床表現(xiàn)包括聽(tīng)力喪失、視網(wǎng)膜色素變性、前庭功能障礙等。不同類(lèi)型的USH在表現(xiàn)和發(fā)病時(shí)間上各有差異。USH為常染色體隱性遺傳。至今，眼科疾病的致病基因鑒定基因解碼鑒定并確認(rèn)了9種致病基因，分別為：Usher 1型（USH1）的MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15和SANS；Usher 2型（USH2）的USH2A、ADGRV1和WHRN；Usher 3型（USH3）的CLRN1。

進(jìn)行性聽(tīng)力損失是USH3的顯著臨床特征。USH3患者通常在8-10歲時(shí)被診斷出聽(tīng)力損失，但在20至30歲之間會(huì)出現(xiàn)快速進(jìn)展的聽(tīng)力喪失。視網(wǎng)膜色素變性（RP）通常在青春期后被診斷，平均診斷年齡為17歲，夜盲癥是最早出現(xiàn)的癥狀。與聽(tīng)力損失的快速進(jìn)展不同，USH3患者的視網(wǎng)膜色素變性的進(jìn)展與USH1和USH2患者的進(jìn)展沒(méi)有顯著差異。青春期后，視桿細(xì)胞退化，導(dǎo)致進(jìn)行性視野喪失，最終發(fā)展為管狀視野和失明。此外，USH3A患者還表現(xiàn)出不同程度的前庭功能障礙，約51%的受檢患者在前庭測(cè)試中顯示異常。

早在1995年，Eeva-Marja Sankila等人將唯一負(fù)責(zé)USH3的基因定位于3q21-25位點(diǎn)。隨后，2002年，Avital Adato等人在人類(lèi)和小鼠中鑒定了USH3A轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)分析USH3A的表達(dá)模式，利用原位雜交技術(shù)在小鼠的耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中鑒定出該基因的轉(zhuǎn)錄本，并將其命名為clarin-1。經(jīng)過(guò)近十年的努力，人類(lèi)CLRN1基因的位點(diǎn)最終被確定為3q25.1。通過(guò)基因解碼明確，與其他四跨膜蛋白類(lèi)似，CLRN1僅保留有限的親水區(qū)，受胞質(zhì)或胞外水相影響，明顯缺乏任何功能結(jié)構(gòu)域，至少已有三種剪接異構(gòu)體被報(bào)道（見(jiàn)圖1）。所有已知的CLRN1突變均位于異構(gòu)體a的三個(gè)外顯子上，除了異構(gòu)體e的外顯子0和外顯子0b之間的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子突變?；蚪獯a表明，CLRN1基因的主要異構(gòu)體編碼一個(gè)232個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)位于第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)中的糖基化位點(diǎn)。

CLRN1在小鼠耳蝸毛細(xì)胞毛束的形態(tài)形成和維持中起著重要作用，也可能具有突觸作用。體外生化分析表明，CLRN1可作為分子支架發(fā)揮作用，在不同質(zhì)膜區(qū)域募集參與細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)，并在組織肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織中發(fā)揮作用。與該功能一致，Clrn1敲除（KO）小鼠和N48K敲除小鼠在幼年時(shí)表現(xiàn)出發(fā)育不良的毛束，并在出生后第21天（P21）嚴(yán)重失聰[。然而，與其他USH疾病小鼠模型類(lèi)似，這些小鼠并不表現(xiàn)出USH3患者的眼部表型。盡管在臨床患者中存在遺傳和表型特征，但CLRN1的分子功能及其與其他Usher基因產(chǎn)物的關(guān)系和相互作用通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)基因檢測(cè)難以明確。

佳學(xué)基因眼科疾病基因檢測(cè)病案集描述了一個(gè)遺傳性耳聾家系的分子病因?qū)W基因解碼。該家系共有2名患者，跨越3代。所有患者均出現(xiàn)雙側(cè)神經(jīng)性聽(tīng)力損失（SHL）、進(jìn)行性視力喪失和夜盲癥。通過(guò)詳細(xì)的臨床病史資料，結(jié)合完整的體格檢查、影像學(xué)檢查和分子病因?qū)W評(píng)估，評(píng)估永生化淋巴細(xì)胞系CLRN1基因的分子致病機(jī)制。本案例明確家系的特殊臨床表型和分子病因，為家系及后代提供實(shí)用有效的遺傳咨詢(xún)，并為USH3在中國(guó)人群的長(zhǎng)期基因解碼提供更多資源。

(A)突變位點(diǎn)出現(xiàn)在 CLRN1 的不同轉(zhuǎn)錄本中。(B) CLRN1 的點(diǎn)突變可導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)錄本中出現(xiàn)不同的氨基酸序列變化
 

臨床評(píng)估

臨床評(píng)估由耳鼻喉科醫(yī)師、眼科醫(yī)生和臨床遺傳學(xué)家完成，包括耳鏡檢查、視覺(jué)強(qiáng)化、聽(tīng)力檢查、鼓室測(cè)量、聲反射、純音聽(tīng)力檢查或播放聽(tīng)力檢查、失真產(chǎn)物誘發(fā)耳聲發(fā)射 (DPOAE)、聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng) (ABR) 和聽(tīng)覺(jué)穩(wěn)態(tài)反應(yīng) (ASSR)。在 0.25–8.0 kHz 的倍頻程下確定雙側(cè)氣導(dǎo) (AC) 閾值。測(cè)量 0.5、1、2 和 4 kHz 對(duì)話頻率下的 AC 平均閾值，并用于定義聽(tīng)力損失嚴(yán)重程度。聽(tīng)力水平被標(biāo)記為輕微 (16–25 dB)、輕度 (26–40 dB)、中度 (41–70 dB)、重度 (71–95 dB) 或極重度 (95 dB)。對(duì)部分家屬進(jìn)行最佳矯正視力、雙眼視覺(jué)誘發(fā)電位（VEP）、視野及眼底檢查，并進(jìn)行高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描（HRCT）檢查，以核實(shí)家屬是否患有聽(tīng)力障礙以外的并發(fā)癥。

外周血樣本

在獲得知情同意后，從所有家系成員、500 名正常對(duì)照個(gè)體（263 名男性和 237 名女性，年齡 18 至 25 歲）和 122 個(gè)無(wú)關(guān)中國(guó)家系采集血液樣本（2 ml + 5 ml）。

靶向基因捕獲和高通量測(cè)序

采用苯酚/氯仿法從受試者的外周血白細(xì)胞中獲取基因組DNA。使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。采用下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)鑒定該家系的致病基因。在靶向捕獲和大規(guī)模并行測(cè)序（MPS）過(guò)程中，使用Covaris S2聚焦超聲（Covaris，馬薩諸塞州，美國(guó)）隨機(jī)切割符合一定標(biāo)準(zhǔn)的先證者（II-4）的合格gDNA，平均片段大小為350–400 bp。然后修復(fù)片段尖端，連接到適配器，并使用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行分析。使用GenCap試劑盒（MyGenostics，北京，中國(guó)）捕獲所有外顯子和側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域，6個(gè)與耳聾相關(guān)的線粒體區(qū)域和139個(gè)與耳聾相關(guān)的核基因的3個(gè)miRNA（補(bǔ)充 表1、2和3 ）。使用 NextSeq 500 下一代測(cè)序儀（美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥 Illumina Inc.）對(duì)捕獲的序列進(jìn)行高通量測(cè)序。

臨床表型分析

患者來(lái)自某三代遺傳性耳聾家系（見(jiàn)圖2A），該家系為常染色體隱性遺傳。先證者為Ⅱ-4，女性，47歲，其父母Ⅰ-1和Ⅰ-2為近親結(jié)婚。患者雙耳聽(tīng)力嚴(yán)重減退（圖2C），雙眼視力低下。大約在10歲時(shí)，患者開(kāi)始出現(xiàn)雙耳聽(tīng)力逐漸喪失的情況；13歲時(shí)，視力障礙逐步加重，并伴有夜盲癥。過(guò)去10年內(nèi)，雙眼視力明顯下降。

眼科檢查（如圖2E所示）顯示，左眼的最佳矯正視力（BCVA）為0.4，右眼為0.7。雙眼的視覺(jué)誘發(fā)電位（VEP）檢查結(jié)果顯示，雙眼P100波峰的潛伏期延遲，且幅度減小。雙眼視野檢查結(jié)果提示出現(xiàn)管狀視野。雙眼彩色眼底檢查結(jié)果表明，視盤(pán)邊界清晰，呈蠟黃色；黃斑區(qū)反光不清；視網(wǎng)膜血管變窄；視網(wǎng)膜呈灰白色，赤道部視網(wǎng)膜可見(jiàn)色素沉著，這些都是晚期視網(wǎng)膜色素變性（RP）的典型表現(xiàn)。

家譜圖（A）、突變信息（B）、聽(tīng)力圖（C）、顳葉CT掃描（D）和眼科信息（E）

（A）家族家譜圖：填充的黑色符號(hào)（男性為方形，女性為圓形）表示患病個(gè)體（II-1、II-4），空心符號(hào)代表未患病個(gè)體。箭頭指向患兒。

（B）DNA序列色譜圖：顯示II-1和II-4的CLRN1基因突變，分別為c.474T > A（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）和c.302T > A（p.Val101Asp，NM_174878.3）這兩種新型純合變異。

（C）聽(tīng)力圖：患病兄弟姐妹的聽(tīng)力圖顯示雙側(cè)嚴(yán)重神經(jīng)性耳聾。橫軸表示音頻頻率（Hz），縱軸表示聽(tīng)力閾值（dB）。

（D）顳葉CT掃描：顳葉CT掃描結(jié)果未見(jiàn)明顯的異常。

（E）眼科檢查：雙眼VEP檢查顯示患兒雙眼P100波峰潛伏期延遲且波幅減小。雙眼視野檢查結(jié)果提示雙眼出現(xiàn)管狀視野。雙眼彩色眼底檢查顯示，雙眼視神經(jīng)乳頭邊界清晰，呈蠟黃色；黃斑區(qū)反光不清；視網(wǎng)膜血管變窄，視網(wǎng)膜呈灰白色，赤道部視網(wǎng)膜出現(xiàn)色素沉著，這些表現(xiàn)均為晚期視網(wǎng)膜色素變性（RP）的典型特征。

II-1為先天性耳聾患者，出生后聽(tīng)力反應(yīng)不佳，自幼視力不佳，但未做過(guò)眼科檢查，已喪失視力及生活自理能力。

靶向高通量測(cè)序及共分離驗(yàn)證結(jié)果

佳學(xué)基因?qū)ο茸C者 (II-4) 的 139 個(gè)耳聾基因的所有編碼外顯子加上約 100 bp 的側(cè)翼內(nèi)含子序列進(jìn)行了測(cè)序。目標(biāo)區(qū)域的平均覆蓋深度在 110–160 倍之間，其中 > 98% 的覆蓋深度 > 20 倍。因此，佳學(xué)基因從面板分析中獲得的結(jié)果不僅在很大程度上排除了 Usher 綜合征基因和導(dǎo)致類(lèi)似綜合征的基因編碼序列中的突變，例如 ABHD12 突變和HARS突變，而且還排除了與耳聾和 RP 相關(guān)的基因同時(shí)發(fā)生的突變，導(dǎo)致模仿 Usher 綜合征的表型。最后，在轉(zhuǎn)錄本NM_001256819.2處檢測(cè)到一種新的純合變體，其中致病性并不總是被報(bào)告，CLRN1:c.474T > A (P.Cys158Ter)，在患者 II-4 和 II-1 中均被檢測(cè)到。如果變體為 c.302T > A，則基于 MANE 選擇轉(zhuǎn)錄本NM_174878.3，該轉(zhuǎn)錄本為 p.Val101Asp。

p.Cys158Ter 突變影響 Clarin-1 功能

CLRN1 c.302T > A ( NM_174878.3 )突變導(dǎo)致101位纈氨酸殘基變?yōu)樘於彼?，如圖 5所示，Alphafold2預(yù)測(cè)軟件顯示CLRN1 c.302T > A導(dǎo)致alpha折疊異常，并未引起其他空間結(jié)構(gòu)變化。而CLRN1 c.474T > A ( NM_001256819.2 )突變發(fā)生在第158位氨基酸，對(duì)應(yīng)cDNA產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止。大片段氨基酸的丟失最終影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（圖 6 ） 。CLRN1 c.474T > A ( NM_001256819.2 )致病性的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)（表 6、7）。

Alphafold2 預(yù)測(cè)軟件顯示 CLRN1c.302T > A 導(dǎo)致 alpha 折疊異常，并未引起其他空間結(jié)構(gòu)變化


CLRN1 c.474T > A( NM_001256819.2 )突變發(fā)生在第158個(gè)氨基酸處，相應(yīng)cDNA產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致翻譯提前終止。

基因檢測(cè)解讀

本案例對(duì)一個(gè)跨三代遺傳性耳聾家系中的2名患者進(jìn)行了臨床表型和分子病因?qū)W分析。根據(jù)先證者和家系中部分患者表現(xiàn)出的進(jìn)行性聽(tīng)力喪失與視力喪失，并結(jié)合先證者的眼科檢查，初步診斷為USH3。經(jīng)分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這2名患者均攜帶CLRN1基因的純合突變：c.474T > A（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）或c.302T > A（p.Val101Asp，NM_174878.3）。隨后，采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證了這些變異位點(diǎn)，并證實(shí)了CLRN1 c.474T>A（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）或c.302T>A（p.Val101Asp，NM_174878.3）突變與該家系的基因型-表型共分離。

USH3的臨床表現(xiàn)主要為語(yǔ)言后進(jìn)行性雙側(cè)對(duì)稱(chēng)性神經(jīng)性耳聾（SHL），伴隨前庭功能減退，通常會(huì)出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性（RP），且發(fā)病年齡一般在20歲之前[7]。盡管如此，USH3的臨床表型具有顯著的遺傳異質(zhì)性和表型特異性。目前已知，CLRN1基因突變是USH3A的主要致病原因，而HARS基因突變則與USH3B相關(guān)[15]。與USH1和USH2相比，USH3較為罕見(jiàn)，盡管Hope等[16]曾報(bào)道USH3占伯明翰地區(qū)USH患者的約20%，而Ness等[5]則指出，該亞型在芬蘭和阿什肯納茲猶太人群體中約占40%。然而，在西班牙人群的基因解碼中，對(duì)89名無(wú)USH3病史的USH患者進(jìn)行分析時(shí)，只有8例為USH3患者，發(fā)病率僅為6%[8]。在中國(guó)人群中，尚未有關(guān)于家族性USH3的報(bào)道，現(xiàn)有病例多為散發(fā)的眼部疾病相關(guān)病例。

由于USH3患者的表型異質(zhì)性不僅在不同家系之間存在顯著差異，甚至在同一家系內(nèi)也表現(xiàn)出較大的異質(zhì)性，Ness等[5]認(rèn)為，合并SHL的USH3患者在表型上較為一致，可作為區(qū)別USH3與USH2、USH1的重要標(biāo)志。另一個(gè)常用的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)是耳聾的發(fā)病時(shí)間，語(yǔ)后SHL是USH3的典型特征，而語(yǔ)前耳聾則更常見(jiàn)于USH1和USH2患者。

在本案例中，先證者展現(xiàn)了典型的USH3臨床癥狀，尤其是在聽(tīng)力、視力以及典型的RP方面，其發(fā)病年齡和進(jìn)展與文獻(xiàn)報(bào)道一致。然而，她的哥哥（II-1）則表現(xiàn)出不同的臨床表型：從出生開(kāi)始雙耳即為重度SHL，夜盲癥早期出現(xiàn)，且雙眼視功能較差，幾乎完全喪失。因此，家族內(nèi)USH3患者的臨床表現(xiàn)存在一定差異。Adato等[17]曾報(bào)道，在一例也門(mén)猶太裔非近親家族中，出現(xiàn)了兩種不同的臨床表型：一例為USH1，另一例為USH3，表明在同一家系內(nèi)，USH的臨床表型可能因不同突變類(lèi)型而有所不同。類(lèi)似地，Ness等[5]也在德系猶太人群中發(fā)現(xiàn)，雖然所有USH患者均攜帶CLRN1基因突變，但攜帶p.N48K純合突變的患者表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的臨床表型，尤其在聽(tīng)力損失的早期和快速進(jìn)展上有明顯特點(diǎn)。

盡管USH3的聽(tīng)力損失進(jìn)展較為緩慢，但一些病例與USH2A、USH1B及USH1D的變異表現(xiàn)相似。隨著病例數(shù)據(jù)的積累，USH3的臨床表型已逐漸呈現(xiàn)更多樣化，基因診斷的準(zhǔn)確性和可靠性也得到提高?；诒景咐推渌墨I(xiàn)的分析，進(jìn)行性SHL和語(yǔ)后耳聾并不一定能作為診斷USH3的決定性標(biāo)準(zhǔn)。

本案例的重要意義體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，NCBI網(wǎng)站記錄了CLRN1基因的四個(gè)轉(zhuǎn)錄本（圖1），由于這些轉(zhuǎn)錄本包含的外顯子不同，因此它們編碼的氨基酸序列也有所差異，這有助于解釋為何CLRN1突變會(huì)導(dǎo)致臨床表型的多樣性。NM_174878.3和NP_777367（isoform a由轉(zhuǎn)錄變體1編碼）包含外顯子0-1-2，編碼一個(gè)約25.8kDa、含232個(gè)氨基酸的clarin-1蛋白[18]。已知的CLRN1突變，除了位于isoform e的外顯子0和外顯子0b之間的內(nèi)含子區(qū)域外，其他都位于isoform a的外顯子3上。除芬蘭人群中的p.Y176X和p.P120K突變[19]，以及阿什肯納茲猶太人群中的p.N48K突變[20]外，其他多數(shù)突變均在單個(gè)家族中發(fā)現(xiàn)。除這些常見(jiàn)突變外，迄今已報(bào)道了21種錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、2種異常剪接突變、7種缺失突變和3種插入突變（截至2023年3月的人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)）。

2017年，Khan等[21]報(bào)道了一個(gè)CLRN1內(nèi)含子突變c.254–649T > G（NM_001256819.1，異構(gòu)體e），該突變發(fā)生在阿拉伯半島的一個(gè)近交系USH1患者中，位于外顯子0和外顯子0b之間的內(nèi)含子區(qū)域。實(shí)驗(yàn)顯示，該突變導(dǎo)致外顯子剪接異常，進(jìn)而導(dǎo)致移碼和提前終止密碼子的產(chǎn)生。這一突變也被認(rèn)為是一個(gè)創(chuàng)始等位基因，對(duì)阿拉伯半島的聾盲患者有顯著影響。

通過(guò)使用Alphafold2預(yù)測(cè)軟件，我們發(fā)現(xiàn)家族性患者攜帶的CLRN1突變[CLRN1 c.474T > A(P.Cys158Ter, NM_001256819.2)或c.302T > A(p.Val101Asp, NM_174878.3)]對(duì)不同轉(zhuǎn)錄本的影響各異。雖然我們未能從患者來(lái)源的ILCL中獲得直接證據(jù)，但在HEK293T細(xì)胞中，我們確認(rèn)了特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，并通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)實(shí)驗(yàn)觀察到c.474T > A(P.Cys158Ter, NM_001256819.2)引起的蛋白表達(dá)差異。這一機(jī)制可能是由于突變導(dǎo)致的可變剪接，從而引起蛋白質(zhì)降解。

CLRN1 c.474T > A（P.Cys158Ter）變異尚未見(jiàn)報(bào)道，至今未在任何公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)等）中出現(xiàn)過(guò)。根據(jù)ACMG/AMP致病性分析指南，這一變異通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，已被證明會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)異常并損害基因功能（PS3），且在正常人群中未見(jiàn)該變異（PM2）。結(jié)合臨床表現(xiàn)和家族基因型-表型共分離的證據(jù)（PP4和PP1），我們最終判斷CLRN1 c.474T > A（P.Cys158Ter）為致病突變，并認(rèn)為這是中國(guó)人群中首次報(bào)道的USH3突變。

基因檢測(cè)結(jié)論

本案例確定CLRN1 c.474T > A純合變異（P.Cys158Ter，NM_001256819.2）在中國(guó)家系中引發(fā)USH3。該突變與芬蘭和阿什肯納茲猶太人群中的常見(jiàn)版本不同，因此其發(fā)現(xiàn)為USH3A的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防基因解碼提供了新的視角，也提示我們?cè)诨蚪獯a不同轉(zhuǎn)錄本時(shí)應(yīng)特別關(guān)注其可能的臨床影響。