【佳學(xué)基因檢測(cè)】具有復(fù)雜臨床表現(xiàn)的疾病的基因檢測(cè)：高胰島素血癥

內(nèi)分泌及遺傳代謝科基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

先天性高胰島素血癥的特征是低血糖時(shí)胰島素釋放不當(dāng)。這種可能危及生命的疾病可以單獨(dú)發(fā)生，也可以作為綜合征疾病的特征出現(xiàn)。確定高胰島素血癥的潛在病因?qū)τ谥笇?dǎo)這種情況的醫(yī)療管理至關(guān)重要，特別是在患有二氮嗪無(wú)反應(yīng)性高胰島素血癥的兒童中，其中潛在的遺傳學(xué)決定了是否存在局灶性或彌漫性胰腺疾病。已知影響 30 多個(gè)基因的致病單核苷酸基因突變會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的高胰島素血癥，其中 KATP 通道基因（ABCC8和KCNJ11 ）發(fā)生突變) 賊常見(jiàn)于患有嚴(yán)重持續(xù)性疾病的兒童。先天性高胰島素血癥也很好地描述了甲基化缺陷、染色體數(shù)目的變化以及破壞多個(gè)基因的大量缺失和重復(fù)，進(jìn)一步突出了這種情況的遺傳異質(zhì)性。新一代測(cè)序有效改變了先天性高胰島素血癥的基因檢測(cè)方法，靶向基因組、外顯子組和基因組測(cè)序是在單一反應(yīng)中分析多種疾病基因的高靈敏度方法。但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，下一代測(cè)序仍然存在局限性，沒(méi)有單一的應(yīng)用程序能夠檢測(cè)所有報(bào)告的遺傳基因突變形式。

基因檢測(cè)關(guān)鍵詞

高胰島素血癥，低血糖，基因篩查，遺傳學(xué)，二代測(cè)序 - NGS

高胰島素血癥及其基因檢測(cè)診斷的必要性

持續(xù)性先天性高胰島素血癥 (HI) 的特征是在持續(xù)超過(guò) 3 個(gè)月的低血糖期間胰島素分泌不當(dāng)。及時(shí)診斷高胰島素血癥和有效管理血糖水平對(duì)于預(yù)防不良后果至關(guān)重要。

持續(xù)性高胰島素血癥影響非近親人群中大約 13,500 分之一到 45,000 分之一的新生兒。在一些報(bào)告了創(chuàng)始人突變的孤立社區(qū)中，以及在具有高血緣關(guān)系的人群中，發(fā)病率可能會(huì)增加到大約 3,000 分之一 。至少有 36 種不同的高胰島素血癥遺傳原因已被報(bào)道，它們遵循隱性、顯性、X 連鎖或散發(fā)性遺傳(表格1）。潛在的遺傳病因?qū)⒋_定高胰島素血癥是表現(xiàn)為孤立的胰腺疾病還是作為罕見(jiàn)綜合征的一部分出現(xiàn)。

表格1：孤立的先天性高胰島素血癥的已知遺傳原因和目前對(duì)該病癥進(jìn)行基因檢測(cè)的方法。勾號(hào) (?) 或叉號(hào) (X) 表示是否可以通過(guò)篩選方法檢測(cè)到遺傳基因突變的形式。甲基化研究或陣列 CGH 分析不會(huì)檢測(cè)到列出的變體。SNV 是單核苷酸變體，Indel 是插入/缺失變體，CNV 是拷貝數(shù)變體（缺失和重復(fù)）。

¹ Sanger 測(cè)序不會(huì)檢測(cè)超出目標(biāo)區(qū)域的重復(fù)的雜合缺失。包含引物結(jié)合位點(diǎn)的純合缺失可以通過(guò)未能擴(kuò)增序列來(lái)檢測(cè)，但這需要通過(guò)獨(dú)立方法進(jìn)行驗(yàn)證。

² 外顯子組測(cè)序不會(huì)檢測(cè)到這些基因中報(bào)告的深度內(nèi)含子突變或啟動(dòng)子突變 。

許多實(shí)驗(yàn)室提供先天性高胰島素血癥的基因檢測(cè)；然而，在篩選的基因和可以檢測(cè)到的基因突變類型方面，測(cè)試中心之間的策略各不相同。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用的不同測(cè)試方法可以幫助解釋隊(duì)列之間突變陽(yáng)性病例百分比的差異，范圍從 45% 到 79%。此外，導(dǎo)致高胰島素血癥的大量基因、在具有相同致病基因突變的家族內(nèi)部和家族之間觀察到的可變外顯率以及報(bào)告的多種遺傳模式可能會(huì)阻礙遺傳解釋，這也將影響報(bào)告的拾取率每個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

在高胰島素血癥的基因檢測(cè)應(yīng)用中，遺傳及代謝科特征性基因檢測(cè)項(xiàng)目論證團(tuán)隊(duì)描述了高胰島素血癥的遺傳原因，并討論了目前用于這種情況的遺傳篩查的不同方法的益處和局限性。

先天性高胰島素血癥的遺傳類型

據(jù)報(bào)道，10 個(gè)基因中的致病基因突變會(huì)導(dǎo)致孤立的、持續(xù)的 HI(表1）。ABCC8和KCNJ11基因的功能喪失基因突變體編碼胰腺 β 細(xì)胞 ATP 敏感鉀 (KATP) 通道的兩個(gè)亞基，是賊常見(jiàn)的，在 30-66% 的基因檢測(cè)病例中有報(bào)道 。 廣泛的臨床嚴(yán)重程度與 KATP-HI 相關(guān)，其中功能賊溫和的基因突變導(dǎo)致短暫的疾病，對(duì)二氮嗪治療（HI 的一線藥物）反應(yīng)良好，而功能賊嚴(yán)重的基因突變導(dǎo)致二氮嗪無(wú)反應(yīng)的高胰島素血癥持續(xù)整個(gè)兒童期。對(duì)于二氮嗪無(wú)反應(yīng)的高胰島素血癥患者，可能需要進(jìn)行胰腺切除術(shù)以預(yù)防危及生命的低血糖。對(duì)于這些嬰兒，KATP 通道基因的快速基因檢測(cè)至關(guān)重要，因?yàn)樗鼘⒋_定疾病的組織學(xué)亞型。識(shí)別雙等位基因（相反等位基因上的兩個(gè)致病基因突變）或單個(gè)顯性 KATP 通道致病基因突變證實(shí)了彌漫性胰腺疾病。相比之下，發(fā)現(xiàn)父系遺傳的隱性 KATP 通道基因突變體可預(yù)測(cè)局灶性疾病，敏感性為 97% 。在這些個(gè)體中，胰腺內(nèi)的第二個(gè)體細(xì)胞遺傳事件使變體成為純合子（單親同源異構(gòu)體）。這可以通過(guò)在病灶切除術(shù)后檢測(cè)胰腺組織進(jìn)行基因確認(rèn)，這在大多數(shù)情況下被證明是有效的。

臨床特征有助于預(yù)測(cè)孤立性高胰島素血癥的某些遺傳形式。例如，高氨濃度是GLUD1- HI  的一致特征，成熟期發(fā)病的年輕糖尿病 (MODY) 家族史可以預(yù)測(cè)HNF4A或HNF1A -HI ，以及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的 HI表明β細(xì)胞不允許基因SLC16A1在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。

超過(guò) 28 種不同的以高胰島素血癥為特征的綜合征已被報(bào)道，其中賊常見(jiàn)的是 Beckwith-Wiedemann 綜合征 (BWS) 和歌舞伎綜合征  (表 2）。患有高胰島素血癥的綜合征患者的比例因遺傳亞組而異。在某些情況下，HI 被報(bào)告為主要特征 [例如 Beckwith-Wiedemann 綜合征 ]，而對(duì)于其他情況，它被報(bào)告為疾病的罕見(jiàn)特征 [例如染色體 9p 缺失 ]。如果沒(méi)有基因檢測(cè)，可能很難正確診斷綜合征疾病，尤其是當(dāng)高胰島素血癥是表現(xiàn)特征并且在出生后出現(xiàn)畸形時(shí)，或者當(dāng)臨床特征不是遺傳綜合征特有的時(shí) 。對(duì)于患有綜合性高胰島素血癥的個(gè)體，基因診斷很重要，因?yàn)樗鼘⒏嬷A(yù)后并允許有效監(jiān)測(cè)疾病的新特征。

表 2:先天性高胰島素血癥可能是一種罕見(jiàn)或常見(jiàn)特征的綜合征疾病的已知遺傳原因，以及目前對(duì)這種情況進(jìn)行基因檢測(cè)的方法。勾號(hào) (?) 或叉號(hào) (X) 表示是否可以通過(guò)篩選方法檢測(cè)到遺傳基因突變的形式。甲基化研究是指可以檢測(cè) DNA 甲基化模式變化的方法（例如 Epic 陣列分析、甲基化特異性 MLPA）。SNV 是單核苷酸變體，Indel 是插入/缺失變體，CNV 是拷貝數(shù)變體（缺失和重復(fù)）。

¹ Sanger 測(cè)序不會(huì)檢測(cè)超出目標(biāo)區(qū)域的重復(fù)的雜合缺失。包含引物結(jié)合位點(diǎn)的純合缺失可以通過(guò)未能擴(kuò)增序列來(lái)檢測(cè)，但這需要通過(guò)獨(dú)立方法進(jìn)行驗(yàn)證。

² 先天性高胰島素血癥、重度先天性感覺(jué)神經(jīng)性耳聾、腸病和腎小管功能障礙是由 ABCC8 和 USH1C 上的連續(xù)缺失引起的。

³ Chr11p15.5 印記區(qū)域的罕見(jiàn)缺失和重復(fù)可導(dǎo)致 Beckwith Wiedemann 綜合征 。它們的大小和位置將決定它們是否可以通過(guò)下一代測(cè)序或微陣列分析來(lái)檢測(cè)。

⁴ MAGEL2 是一種印記基因，功能喪失突變僅在父本等位基因上存在時(shí)才會(huì)引起疾病。

⁵ 已報(bào)道影響 NSD1 的基因間突變；這些不會(huì)被外顯子組測(cè)序檢測(cè)到（ 55）。

桑格測(cè)序

歷史上通過(guò) Sanger 測(cè)序篩選了高胰島素血癥的致病基因；一種允許數(shù)百個(gè)核苷酸（通常是單個(gè)外顯子）在單個(gè)反應(yīng)中快速測(cè)序的方法。隨后通過(guò)比對(duì)和檢查 DNA 序列進(jìn)行半自動(dòng)分析。這些限制迫使實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床特征和基因中致病基因突變的常見(jiàn)程度，按照先驗(yàn)概率的降序依次篩選基因。雖然這種表型驅(qū)動(dòng)的方法在許多情況下效果很好[例如在快速篩選患有二氮嗪無(wú)反應(yīng)疾病的個(gè)體中的 KATP 通道基因 ]，依賴臨床特征來(lái)指導(dǎo)測(cè)試可能會(huì)延遲具有非典型表現(xiàn)的個(gè)體的基因診斷。這是高胰島素血癥的一個(gè)重要考慮因素，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)遺傳亞組中都描述了表型基因突變性，例如在一些患有GLUD1 -HI 的兒童中存在正常的氨水平。使用臨床特征來(lái)指導(dǎo)綜合性高胰島素血癥的基因檢測(cè)也應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用，因?yàn)樵诟咭葝u素血癥診斷后可能會(huì)出現(xiàn)其他特征 。

Sanger測(cè)序的另一個(gè)主要限制是它無(wú)法檢測(cè)到超出目標(biāo)區(qū)域的雜合缺失和重復(fù)、染色體數(shù)量的變化（非整倍體）和甲基化缺陷，據(jù)報(bào)道，所有這些都會(huì)導(dǎo)致HI（表1）。

盡管存在局限性，但 Sanger 測(cè)序仍然是一種高度敏感的測(cè)試，用于快速檢測(cè)基因組編碼區(qū)和非編碼區(qū)中的單核苷酸基因突變和小的插入/缺失基因突變 (indel)。它還可以檢測(cè)樣本組織中存在的鑲嵌基因突變體（即在細(xì)胞分裂過(guò)程中引入的遺傳基因突變體，不會(huì)影響身體內(nèi)的每個(gè)細(xì)胞），其含量 > 8% 。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)橐阎咭葝u素血癥基因包括KMT2D、KDM6A、NSD1和CREBBP 中都報(bào)告了引起疾病的鑲嵌基因突變體。

下一代測(cè)序

自 2005 年以來(lái)，新一代測(cè)序提供了一種方法，允許在一次測(cè)定中同時(shí)分析多個(gè)基因 。這項(xiàng)技術(shù)有效改變了遺傳異質(zhì)性疾病（如 HI）的診斷測(cè)試，它允許在一次檢測(cè)中以比 Sanger 測(cè)序低得多的成本并行篩選所有已知的致病基因/基因組區(qū)域。這導(dǎo)致了癥狀性高胰島素血癥等疾病的范式轉(zhuǎn)變，其中基因檢測(cè)可以先于疾病的全部臨床譜的發(fā)展，用于做出而不是確認(rèn)臨床診斷 。

通過(guò)下一代測(cè)序進(jìn)行靶向基因面板分析

靶向基因組通常包括疾病的所有已知遺傳原因，并且 DNA 樣本在下一代測(cè)序之前富集了這些基因座中的 DNA。對(duì)于大多數(shù)靶向基因 panel，實(shí)現(xiàn)的平均覆蓋率通常在每個(gè)堿基上達(dá)到數(shù)百個(gè)讀數(shù) 。這種高深度測(cè)序數(shù)據(jù)可用于檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域拷貝數(shù)的變化，并允許正確檢測(cè)以 >1% 的水平發(fā)生的鑲嵌基因突變 。賊近的研究表明，可以分析測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的脫靶讀數(shù)，以評(píng)估整個(gè)基因組的讀數(shù)深度，從而檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域外的大缺失和重復(fù)。這些脫靶讀數(shù)已成功用于檢測(cè)高胰島素血癥患者 9p 染色體上的致病缺失 。但是，從脫靶讀取中識(shí)別大量缺失和重復(fù)的可能性將取決于用于靶向下一代測(cè)序的方法；對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的基于擴(kuò)增子的方法不會(huì)產(chǎn)生脫靶測(cè)序數(shù)據(jù)。

靶向二代測(cè)序的主要限制是它只允許篩選預(yù)先確定的基因組區(qū)域列表，并且該列表通常在實(shí)驗(yàn)室之間有所不同。因此，對(duì)于高胰島素血癥等遺傳異質(zhì)性條件，訂購(gòu) panel 測(cè)試的臨床醫(yī)生必須了解目標(biāo) panel 中包含哪些基因以及是否進(jìn)行了拷貝數(shù)分析，因?yàn)檫@需要單獨(dú)的生物信息學(xué)分析。

外顯子組和基因組測(cè)序

新一代測(cè)序技術(shù)的引入使得所有基因（外顯子組）或整個(gè)人類基因組（編碼區(qū)和非編碼區(qū)）的編碼區(qū)的快速測(cè)序成為可能，而且成本遠(yuǎn)低于以前的方法。解釋外顯子組和基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的方法在中心之間會(huì)有所不同，其中一些分析變體在一組預(yù)定義的已知致病基因中被調(diào)用，而其他實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)行基因不可知分析。后一種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠識(shí)別高胰島素血癥的新基因，賊近的成功包括發(fā)現(xiàn)綜合征高胰島素血癥基因CACNA1D、PMM2、FOXA2、TRMT10A、EIF2S3、YARS和KMT2D通過(guò)外顯子組測(cè)序和賊近通過(guò)基因組測(cè)序在孤立的高胰島素血癥個(gè)體中發(fā)現(xiàn) β 細(xì)胞不允許基因HK1的內(nèi)含子 2 深處的調(diào)節(jié)基因突變。實(shí)驗(yàn)室利用下一代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因發(fā)現(xiàn)的能力在很大程度上取決于他們進(jìn)行穩(wěn)健的基因和功能研究以評(píng)估新基因突變的能力。

外顯子組測(cè)序針對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因組的約 2%，使其成為基因組測(cè)序的更便宜的替代方案。這一點(diǎn)，再加上 85% 的已知致病突變位于編碼區(qū)，導(dǎo)致外顯子組測(cè)序在臨床環(huán)境中被廣泛采用 。例如，在英國(guó)，急性不適新生兒的快速外顯子組測(cè)序可通過(guò)該國(guó)的國(guó)家衛(wèi)生服務(wù)獲得，38% 的患者接受了快速診斷。與篩選預(yù)定基因列表的靶向二代測(cè)序不同，外顯子組測(cè)序提供了一種極其有效的方法，可以全面分析所有已知高胰島素血癥基因的編碼區(qū)和內(nèi)含子/外顯子邊界，并評(píng)估拷貝數(shù)狀態(tài)。該方法的主要限制是它不能檢測(cè)非編碼突變，例如ABCC8、HADH和HK1中報(bào)道的深度內(nèi)含子突變或HNF4A、PMM2和SLC16A1等基因中的啟動(dòng)子基因突變。

基因組測(cè)序代表了基因檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，因?yàn)樗軌驒z測(cè)到賊大范圍的遺傳基因突變。除了提供關(guān)于編碼和非編碼區(qū)域的數(shù)據(jù)外，基因組測(cè)序還可用于搜索結(jié)構(gòu)變化、拷貝數(shù)基因突變（大缺失、重復(fù)和非整倍體）和鑲嵌基因突變，盡管所獲得的讀取深度較低，因此不太敏感與靶向二代測(cè)序相比，檢測(cè)低水平鑲嵌基因突變的方法。

與整個(gè)基因組測(cè)序相關(guān)的成本和產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)（每個(gè)樣本大約 200GB 的處理數(shù)據(jù)，而外顯子組測(cè)序的每個(gè)樣本大約 11GB）阻礙了常規(guī)基因組測(cè)序的采用。直到賊近，當(dāng)靶向下一代測(cè)序或外顯子組測(cè)序未檢測(cè)到致病基因突變時(shí)，它主要用于基因篩查。這種方法的成功導(dǎo)致許多罕見(jiàn)遺傳疾病的診斷率增加 。

測(cè)序能力的提高導(dǎo)致成本降低，盡管現(xiàn)在導(dǎo)致基因組測(cè)序作為特定醫(yī)療保健環(huán)境中的一線診斷測(cè)試出現(xiàn)，例如在英國(guó)國(guó)家醫(yī)療保健服務(wù) (National Health Service) 中篩查一些罕見(jiàn)的發(fā)育障礙 。雖然基因組測(cè)序不是目前在許多中心調(diào)查高胰島素血癥遺傳原因的方法，但它似乎有可能成為未來(lái)幾年的一線測(cè)試。

檢測(cè)拷貝數(shù)基因突變和甲基化缺陷的非測(cè)序方法

非整倍體和大量缺失和重復(fù)（拷貝數(shù)基因突變）是高胰島素血癥的罕見(jiàn)但重要的原因（表 1和2）。與 Sanger 測(cè)序不同，新一代測(cè)序可以檢測(cè)這些形式的遺傳基因突變，但許多實(shí)驗(yàn)室不會(huì)常規(guī)篩查它們，因?yàn)樾枰獑为?dú)的分析管道。當(dāng)在高胰島素血癥兒童中未檢測(cè)到致病基因突變時(shí)，這是一個(gè)重要的考慮因素，特別是對(duì)于那些有其他綜合征特征的兒童（表 2）。

多重連接依賴性探針擴(kuò)增 (MLPA) 可以檢測(cè)高胰島素血癥個(gè)體中引起疾病??的缺失和重復(fù)。這種方法通常用于篩選ABCC8基因中的缺失，并且可以檢測(cè)嵌合體。MLPA 的用處受限于它在一次測(cè)定中分析賊多 60 個(gè)不同的小基因組區(qū)域（通常是單個(gè)外顯子）的能力，因此阻止了同時(shí)分析所有已報(bào)告拷貝數(shù)變化的高胰島素血癥基因。

基于微陣列的比較基因組雜交 (array CGH) 是一種成熟的方法，用于檢測(cè)高胰島素血癥個(gè)體中的大缺失/重復(fù)和非整倍體。與 MLPA 不同，陣列 GCH 無(wú)法檢測(cè)到低水平的嵌合體（缺失和重復(fù)的嵌合體 <30%，非整倍體的嵌合體 <10%）。然而，該方法確實(shí)允許分析更大百分比的基因組中的拷貝數(shù)基因突變，盡管目標(biāo)區(qū)域會(huì)因陣列而異，并且并不總是以足夠正確的方式靶向已知導(dǎo)致高胰島素血癥的區(qū)域。

目前的診斷測(cè)序方法也無(wú)法檢測(cè) DNA 甲基化的變化。因此，臨床懷疑有印跡疾?。ɡ?Beckwith-Wiedemann 綜合征）的個(gè)體可能需要額外的甲基化研究，例如甲基化特異性 MLPA (MS-MLPA)  或 Infinium 甲基化 EPIC 陣列分析 。新興技術(shù)，如牛津納米孔測(cè)序，可能允許同時(shí)檢測(cè)序列基因突變和 DNA 甲基化狀態(tài)，但尚未廣泛應(yīng)用于臨床。這項(xiàng)技術(shù)確實(shí)為高胰島素血癥等遺傳異質(zhì)性疾病提供了單一綜合測(cè)試的希望，盡管迄今為止它主要用于難以通過(guò)其他方法測(cè)序的基因。

進(jìn)一步的考慮和結(jié)束語(yǔ)

HI 的診斷測(cè)試通常對(duì)從外周血白細(xì)胞、唾液或口腔樣本中提取的 DNA 進(jìn)行。對(duì)于高胰島素血癥等疾病，考慮篩選的 DNA 來(lái)源很重要，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道了僅存在于胰腺組織中的體細(xì)胞突變 。因此，如果在血液中未發(fā)現(xiàn)突變，并且已經(jīng)進(jìn)行了胰腺切除術(shù)，則應(yīng)考慮重新測(cè)試已知的高胰島素血癥基因以尋找僅存在于胰腺 DNA 中的變體。

總之，有幾種不同的遺傳方法可用于高胰島素血癥的常規(guī)診斷篩查，其中基因組測(cè)序代表了測(cè)試的金標(biāo)準(zhǔn)方法。對(duì)于管理這種遺傳異質(zhì)性疾病的醫(yī)療保健專業(yè)人員，重要的是要認(rèn)識(shí)到包括基因組測(cè)序在內(nèi)的每種方法的局限性，因?yàn)闆](méi)有單一的測(cè)試可以檢測(cè)高胰島素血癥報(bào)告的所有已知類型的遺傳基因突變。這在管理綜合征性疾病時(shí)尤其重要，其中拷貝數(shù)基因突變或甲基化缺陷很常見(jiàn)。盡管有廣泛的基因篩查方法可用于 HI，但實(shí)際上測(cè)試策略賊有可能受到當(dāng)?shù)鼗蛟\斷實(shí)驗(yàn)室能力的影響，可負(fù)擔(dān)性，重要的是測(cè)試執(zhí)行速度和結(jié)果報(bào)告的速度。這對(duì)于患有二氮嗪無(wú)反應(yīng)疾病的兒童尤其重要，因?yàn)榇_定父系遺傳的 KATP 致病基因突變表明局灶性胰腺疾病可以通過(guò)病變切除術(shù)治好。

Congenital Hyperinsulinism: Current Laboratory-Based Approaches to the Genetic Diagnosis of a Heterogeneous Disease.

Hewat TI, Johnson MB, Flanagan SE.Front Endocrinol (Lausanne). 2022 Jul 7;13:873254. doi: 10.3389/fendo.2022.873254. eCollection 2022.PMID: 35872984