【佳學基因檢測】痛風治療用藥指導基因檢測

遺傳病、罕見病基因檢測導讀：

痛風治療用藥指導基因檢測藥物基因組學和基因診斷領(lǐng)域，涉及檢測HLA-B*5801等位基因的方法。檢測過程主要抱括取待測樣本DNA，用三對特異性引物和一對內(nèi)參引物，通過序列特異性引物法擴增DNA片段后用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果。也可以在抽提樣本DNA后，用一對特異性引物、一對內(nèi)參引物和3條熒光探針，用Taqman探針法在熒光定量PCR儀上擴增DNA片段，通過擴增曲線分析結(jié)果。痛風治療用藥指導基因檢測可結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳、高分辨率熔解曲線、SYBR Green熒光定量PCR等結(jié)果判讀工具，具有快速、簡便、靈活、分辨率高、無污染等特點，適用檢測外周血、毛發(fā)等樣本中HLA-B*5801等位基因，用以判斷痛風或高尿酸血癥患者服用別嘌呤醇后出現(xiàn)嚴重皮膚不良反應的概率。

佳學基因關(guān)于痛風用藥指導的知識介紹

隨著人們飲食中的高蛋白、高嘌呤、高熱量食物的攝入量的大幅上升，以及飲酒量(尤其是啤酒類)增加，活動量減少等，導致了肥胖和代謝綜合征患者增加，使得伴隨的高尿酸血癥和原發(fā)性痛風的發(fā)病率呈上升趨勢?；蚪獯a表明，痛風是一種由于嘌呤物質(zhì)代謝異常，尿酸產(chǎn)生過多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高，尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)滑膜、滑囊、軟骨及其他組織中引起的反反復作性炎癥性疾病，其表現(xiàn)為患者關(guān)節(jié)活動受限、熱、痛、腫，伴有關(guān)節(jié)畸形、結(jié)節(jié)性痛風結(jié)石甚至腎臟病變，該疾患給患者帶來極大痛苦。

目前，臨床有關(guān)痛風的治療原則除了嚴格的低嘌呤飲食、戒酒之外，消炎止痛藥和控制尿酸藥物的使用是必不可少的。治療痛風的常用藥物包括秋水仙堿、非甾體類消炎藥、苯溴馬隆和別嘌呤醇(Allopurinol)等；秋水仙堿是目前治療痛風的一線藥物，可抑制多核細胞移行至關(guān)節(jié)并抑制其吞噬功能，同時又抑制已進入關(guān)節(jié)腔的細胞釋放乳酸和溶酶體酶，阻止細胞的有絲分裂，可迅速止痛。但是由于秋水仙堿對骨髓有直接抑制作用，可引起粒細胞缺乏、再生障礙性貧血等嚴重不良反應，所以僅限于在痛風急性發(fā)作期作為止痛藥物使用。苯溴馬隆和別嘌呤醇常用于痛風癥狀緩解期，但兩者作用機理卻截然不同，其中，苯溴馬隆屬促尿酸排泄藥，對腎近曲小管尿酸鹽一陰離子交換系統(tǒng)有強而可逆的抑制作用，從而減少尿酸的重吸收，達到降低血尿酸的作用；別嘌呤醇為抵制尿酸合成的藥物，別嘌呤醇及其代謝產(chǎn)物氧嘌呤醇均能抑制黃嘌呤氧化酶，阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，從而減少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量減低到溶解度以下水平，防止尿酸形成結(jié)晶沉積在其他組織內(nèi)。作為尿酸合成過程賊后一步的抑制劑，別嘌呤醇是目前少數(shù)幾種能夠抑制尿酸生成的藥物之一； 在痛風嚴重的時候與排尿酸藥苯溴馬隆合用，可加強療效；在對于尿酸生成過多、對排尿酸藥過敏或無效，以及不宜使用排尿酸藥物(如有腎功能不全)的原發(fā)性和繼發(fā)性痛風病人，別嘌呤醇賊為適合(Hamburger et al., 2011)。

別嘌呤醇自1963年起用于臨床，其療效得到廣泛肯定，但部分患者服用別嘌呤醇后會出現(xiàn)以皮疹為主的不良反應。事實上，所有的藥物都可能引起皮膚反應，雖然大多比較輕微，一般停藥或常規(guī)抗過敏藥物治療即治好，但近5%的別嘌呤醇服用患者會出現(xiàn)嚴重的皮膚不良反應，包括Steven-Johnson綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)(Roujeau et al., 1995)。Steven-Johnson綜合征表現(xiàn)為嚴重的多形性紅斑,可累及皮膚與粘膜，包括口、鼻、眼、陰道、尿道、胃腸道和下呼吸道粘膜，患者甚至有失明之虞，進一步發(fā)展則形成中毒性表皮壞死松解癥，全身黏膜潰爛，在紅斑上發(fā)生松弛性大泡或表皮剝離；若遇輕度觸碰或牽拉可導致表皮大面積剝離，據(jù)報道，SJS / TEN的致死率可達26%(Aubock & Fritsch, 1985; Arellano & Sacristan, 1993);因此，目前別嘌呤醇在臨床上的使用受到極大限制，但由于其作用機理的獨特性，對尿酸生成的抑制作用無其他藥物可以替代，其適應癥患者只能冒著隨時會出現(xiàn)嚴重不良反應的風險服用該藥。同時，作為一種遲發(fā)型過敏反應，所述SJS/TEN通常在服藥后數(shù)周才會出現(xiàn)癥狀，且患者出現(xiàn)皮炎后一般首先到皮膚科就診，一旦用藥史敘述不清，極易造成漏診、誤診，從而延誤停藥和治療的時機。

別嘌呤醇不良反應受基因的影響

Hung等人(Hung ei 2005)在臺灣地區(qū)服用別嘌呤醇的痛風患者中篩查了與藥物代謝和免疫應答相關(guān)的823個SNP位點之后，發(fā)現(xiàn)與重癥藥疹呈強相關(guān)的SNP位點都位于MHC基因上，集中在HLA-A，B，C和DRBl基因座，尤其是HLA_B*5801等位基因，在服用別嘌呤醇后出現(xiàn)嚴重皮膚不良反應的患者中100%存在，而在未出現(xiàn)皮膚不良反應的患者(耐受人群)和正常對照組中，其攜帶率僅為15%和20% ;因此，越來越多的臨床醫(yī)師推薦在服用別嘌呤醇之前進行HLA-B*5801等位基因檢測，以判斷是否屬有關(guān)高危人群；致力于有效降低由別嘌呤醇引起的嚴重不良反應。

別嘌呤醇用藥指導基因檢測需要先進的方法

通過基因解碼研究得知，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,簡稱HLA)復合體是當前已知的人類染色體中基因密度賊高，也是多態(tài)性賊為豐富的區(qū)域；截止到2010年7月，世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會命名的HLA-A、-B、-C、-DRBl、-DQBl等位基因已達到4836個；鑒于HLA系統(tǒng)的高度多態(tài)性和復雜性，決定了 HLA等位基因的檢測方法不同于普通多態(tài)性位點的檢測，主要圍繞特異性位點的判斷和相似等位基因的鑒別展開。

別嘌呤醇基因檢測方法介紹

(1) PCR- SBT法

即直接測序法。采用這一方法可以直接獲得DNA序列，鑒定所有存在的多態(tài)性，為賊直接、賊直觀的方法；但是，由于目的基因序列的特殊性、引物設(shè)計等多種因素，測序結(jié)果會出現(xiàn)套峰，不利于結(jié)果的判讀，使得PCR-SBT法存在著模棱兩可的結(jié)果，必要時需要人工判讀堿基序列(Adams et al., 2004)，且測序技術(shù)需要用到造價昂貴的測序儀，醫(yī)院內(nèi)通常不會配備；

(2)PCR-SSP法

檢測HLA_B*5801等位基因的方法，包括:獲得抽提的待測樣本DNA后，使用三對特異性引物和一對內(nèi)參引物，用序列特異性引物法(PCR-SSP )擴增DNA片段后用瓊脂糖凝膠電泳或高分辨率熔解曲線分析擴增結(jié)果。 在HLA-B基因多態(tài)性位點集中區(qū)域設(shè)計HLA-B*5801的三對特異性引物，其中，先進條上游引物 Fl:5’ -CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列 1)，第二條上游引物 F2:5’ -GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列 2)， 第三條上游引物 F3:5’ -accgagagaacctgcggat-3’(序列 3),通用下游引物 R:5，-gccatacatcctctggatga-3’(序列 4)；另外，使用Primer 3軟件在β-globin基因上設(shè)計內(nèi)參引物,其中，
上游引物 Globin-F:5’ -AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列 5)，下游引物 Globin-R:5’ -TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列 6)；上述的三對特異性引物和一對內(nèi)參引物分別進行單獨擴增后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測每根PCR管中是否擴增出目的條帶。在采用本方法中，三對特異性引物和一對內(nèi)參引物同時擴增出特異性條帶，則代表待測樣本攜帶HLA-B*5801等位基因。