【佳學(xué)基因檢測】病源微生物基因檢測
導(dǎo)讀
佳學(xué)基因病源微生物基因檢測采用發(fā)現(xiàn)新冠肺炎病毒的高通量核酸檢測技術(shù),在不需要培養(yǎng)的條件下,對血液、組織液、身體或者是器官表面進(jìn)行細(xì)菌、真菌、微生物、病毒等進(jìn)行檢查、鑒定的一種基因檢測方式。
病原體基因檢測項目
病源微生物又叫做病源體、感染性微生物、感染性細(xì)胞、感染性真菌。為了減輕受檢者的檢測費用,如果導(dǎo)致某一種疾病發(fā)生的病源體的種類比較清晰,可以只選擇某一類微生物的病源體檢測。如果可以導(dǎo)致感染的病源體的種類比較多,可以選擇不確定有害微生物種類的病源微生物核酸檢測。
佳學(xué)基因病源體基因檢測項目mNGS對現(xiàn)有技術(shù)的革新
1)傳統(tǒng)方法介紹
傳統(tǒng)的病源體檢測是采用涂片鏡檢的方法,是指將待檢樣品取材、制片后在顯微鏡下觀察、分析和判斷樣品中微生物種類的一種臨床診斷方法,通常用于疾病的初步判斷。人體的排泄物、分泌物或病患組織都可以作為檢查對象。常見的涂片鏡檢有革蘭氏染色法,可檢出革蘭氏陽性菌(如肺炎雙球菌、炭疽桿菌)、陰性菌(如百日咳桿菌、痢疾桿菌)。經(jīng)過包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等步驟后,革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)紫色,革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)紅色并且由于染色使得細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征更易于觀察,從而更利于分類鑒定。
生化方法是通過檢測微生物表達(dá)的特異性的酶,從而鑒定微生物種類的方法。使用特定的底物,檢測微生物代謝底物的能力,即可判斷微生物是否具有某種特定的酶。例如檢測沙門氏菌的辛酯酶法。各屬腸桿菌科細(xì)菌中只有沙門氏菌表達(dá)辛酯酶,根據(jù)這一特性,甄宏太等開發(fā)了快速檢測沙門氏菌的辛酯酶法。該方法是以42甲基傘形酮辛酯(MUCAP)為底物,在沙門氏菌的酶促反應(yīng)后,生成4MU,在紫外燈下可觀察到藍(lán)色熒光。該方法在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成,適合病菌的初步篩查。
全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)是一種集生化反應(yīng)、計算機(jī)和自動化技術(shù)于一體的檢測技術(shù),具有速度快,通量高的優(yōu)點。常見儀器如法國生物梅里埃公司的VITEK系統(tǒng)和美國BD公司的PHOENIX系統(tǒng)。自動化系統(tǒng)可進(jìn)行多達(dá)幾十種的微量生化反應(yīng)和藥敏生長試驗,根據(jù)各生化反應(yīng)孔中的生長變化及呈色反應(yīng)情況,由計算機(jī)通過數(shù)值編碼技術(shù)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析,得到鑒定結(jié)果。
免疫學(xué)檢測是利用抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,對樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測。既可以檢測病原菌的抗原,也可以檢測免疫細(xì)胞的抗體??乖瓩z測可以確認(rèn)病原菌,而抗體檢測則是病人健康評估的方法,兩者相輔相成。通常將待檢測的抗原(或抗體)結(jié)合蛋白預(yù)先連接上某種標(biāo)記物,借助標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度,在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定位或定量研究。比如診斷肺炎時可通過肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌尿抗原檢測及血清隱球菌莢膜多糖抗原檢測診斷醫(yī)院獲得性肺炎。
微生物培養(yǎng)是通過培養(yǎng)樣品中的微生物再結(jié)合檢測液體菌液濃度(對應(yīng)固體培養(yǎng)基檢測菌落數(shù))、或聯(lián)合生化或免疫學(xué)檢測對微生物進(jìn)行鑒定的方法。例如羅氏培養(yǎng)法可以用于診斷肺結(jié)核病。羅氏培養(yǎng)基可促進(jìn)分枝桿菌的生長并抑制其他雜菌,經(jīng)培養(yǎng)3-4周后分枝桿菌形成菌落,呈干燥顆粒狀,乳白色或米黃色,形似花菜心。
2)mNGS與傳統(tǒng)方法的比較
其他基于NGS方法介紹
PCR擴(kuò)增后測序是擴(kuò)增富集已知病原體基因片段之后再測序。由于只擴(kuò)增部分基因,該方法的測序成本較mNGS更低。但該方法對于未知病源的感染無能為力。例如,16S rRNA是原核生物(比如細(xì)菌)核糖體的組成部分。核糖體是序列高度保守的基因,可將擴(kuò)增引物設(shè)計在多物種共同的序列區(qū)域擴(kuò)增16S rRNA片段,之后再測序、比對鑒定微生物類別。
目標(biāo)DNA區(qū)域捕獲并測序的方法與PCR擴(kuò)增思路類似,通過篩選出部分基因進(jìn)行測序,從而降低成本。區(qū)別是篩選基因的方法:通過設(shè)計核酸探針(生物素標(biāo)記)互補(bǔ)結(jié)合到待測病原體的基因組區(qū)域,從而捕獲特定的病原體基因組片段,繼而對這些片段進(jìn)行測序。
mNGS與其他基于NGS方法的比較
1)新興方案介紹
PCR檢測技術(shù)是利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR),在DNA聚合酶催化下,以樣品中提取的微生物基因組DNA為模板,選取特定微生物表達(dá)的特異基因設(shè)計引物,以是否能擴(kuò)增出特異基因以及基因條帶的位置來鑒定病原微生物種類的方法。例如對布魯菌的bcsp31基因設(shè)計特異性引物再通過PCR擴(kuò)增可快速檢測血液、組織等標(biāo)本中是否含有布魯菌。
質(zhì)譜檢測技術(shù)通過對待測樣本進(jìn)行檢測,獲得其蛋白質(zhì)圖譜,再與已知微生物構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫的參考圖譜進(jìn)行比對,從而鑒定病原微生物的方法。
2)mNGS與其他新興方案的比較
mNGS在臨床中的應(yīng)用
mNGS具有檢測全面,正確率高,敏感度高和時間短的優(yōu)勢。鑒定樣品中病原微生物時,mNGS可以補(bǔ)充或替代傳統(tǒng)的生化、免疫和培養(yǎng)方法,更快更加正確地取得結(jié)果。更重要的是,傳統(tǒng)方法在應(yīng)對少見、罕見感染,新發(fā)性感染時常常束手無策,mNGS通過檢測樣品中全微生物物種,從而找出潛在的致病微生物,指導(dǎo)用藥。
在新發(fā)傳染病疫情中的應(yīng)用
在新發(fā)傳染病疫情的發(fā)現(xiàn)和控制中,mNGS發(fā)揮了越來越重要的作用。2011年德國產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)O104:H4暴發(fā),沒有相應(yīng)診斷試劑及標(biāo)準(zhǔn)可用于該新亞型,給檢測帶來了極大的難度。在多個高通量測序系統(tǒng)合力開展了宏基因組測序分析后,成功完成了菌株的基因組序列的重建,迅速確認(rèn)了致命德國腸出血性大腸桿菌O104:H4。至今,mNGS在多次疫情中檢測出致病菌,起到了鑒別病菌、控制疫情的作用。
在感染性疾病診斷中的應(yīng)用
mNGS用于感染性疾病的診斷新穎由加州大學(xué)Charles Y. Chiu團(tuán)隊于2014年報道,發(fā)表在《英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》。1例14歲患者,頭痛、發(fā)熱反復(fù)住院8個月,在進(jìn)行了38種不同的診斷試驗(從血清學(xué)到培養(yǎng)和活檢),仍然無法明確其致病病原體,并進(jìn)入了昏迷狀態(tài)。賊終團(tuán)隊使用mNGS檢測其腦脊液樣品,確診為鉤端螺旋體感染。隨即給予針對性的青霉素治療,32天后患者治好出院。此后該項技術(shù)廣泛用于多種感染性疾病的診斷。
在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中mNGS的報道
據(jù)估計經(jīng)過全面深入的傳統(tǒng)檢查后仍有30%~60%的腦炎病例無法明確其病因。使用mNGS檢測可檢查出所有微生物,幫助診斷病毒性(DNA病毒和RNA病毒)腦炎。2015年,德國報道了3例基底節(jié)腦炎患者,患者臨床上以基底節(jié)病變?yōu)橹?,發(fā)病急驟,死亡率高,通過mNGS在腦內(nèi)檢測到松鼠博爾納病毒,這是新穎發(fā)現(xiàn)松鼠博爾納病毒傳染人類的證據(jù)。2015年,日本Sakiyama等報道了4例表現(xiàn)為腦脊髓膜炎的漁民,常規(guī)檢查未能明確其致病病原體,通過mNGS檢測發(fā)現(xiàn)其感染了以前從未曾報道的屬于古細(xì)菌域的嗜鹽菌(Halobacterium),在給予復(fù)方磺胺甲惡唑治療后患者有效好轉(zhuǎn)。上述報道均表明,mNGS檢測在診斷罕見的、新發(fā)的或不典型的病原微生物(如鉤端螺旋體、星狀病毒、古細(xì)菌、博爾納病毒)時發(fā)揮出了獨特的優(yōu)勢,可以有效檢測病原微生物并且指導(dǎo)用藥。
在呼吸道感染性疾病中mNGS的報道
在呼吸道感染中,除血液標(biāo)本外,mNGS已用于多種呼吸道多種標(biāo)本的檢測,包括痰、咽拭子、胸水、支氣管肺泡灌洗液、膿液及肺活檢標(biāo)本等。
謝云等報道了一項關(guān)于mNGS技術(shù)應(yīng)用于重癥肺炎的病原體檢測效果的回顧性研究,對照組及mNGS組共178例患者。對照組130例患者送檢痰、血及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本做常規(guī)的微生物培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物使用;mNGS組48例患者加做mNGS,根據(jù)mNGS檢測結(jié)果調(diào)整抗菌藥物的使用。賊后以28天,90天死亡率為指標(biāo),mNGS組均顯著低于對照組,說明在mNGS結(jié)果的輔助下,患者的見效率顯著更高。胡必杰等報道了應(yīng)用mNGS檢測病原體的一項大樣本回顧性研究分析,納入可分析數(shù)據(jù)的511例患者。通過分析發(fā)現(xiàn)mNGS較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法敏感性提高近15%。
在小兒感染性疾病中mNGS的報道
王春花等人基于NGS方法優(yōu)化的測序方法分別對94份重癥病例和150份輕癥病例臨床樣本進(jìn)行了測序分析,共檢出哺乳動物病毒科和植物病毒科共13種病毒。此外還檢測出了多種腸道病毒不同型別之間、腸道病毒與非腸道病毒之間的混合感染事件,為手足口病的臨床診斷提供了一種正確檢測方法。嚴(yán)重急性呼吸道感染(Severe Acute Respiratory Infection, SARI)是兒童住院和感染死亡的重要原因之一。王延群等人對135份SARI兒童和15份非SARI兒童的呼吸道樣品進(jìn)行了mNGS測序 ,檢測出病毒種類和主要病毒性病原,同時也通過比較病毒基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)感染組和對照組之間不同的病毒群落分布特點以及各個組內(nèi)的特異性病毒特征。
應(yīng)用病種流行病學(xué)特征
呼吸系統(tǒng)感染性疾病
國際呼吸協(xié)會論壇(Forum of International Respiratory Societies)于2017年發(fā)布了《全球呼吸道疾病概況》,介紹了全球前五大呼吸系統(tǒng)致死疾病的流行病學(xué)數(shù)據(jù)以及預(yù)防、控制和治療方案,其中包括感染類疾病:下呼吸道感染和肺結(jié)核。
下呼吸道感染和肺炎每年會導(dǎo)致全球多于四百萬人死亡,在低收入和中收入國家中尤其嚴(yán)重。2015年,有920,136名兒童(五歲以下,新生兒期以外)死于下呼吸道感染和肺炎,占該年齡段死亡人數(shù)的15%。這也是多年來早逝和住院治療的第二大原因。每年流感病毒會導(dǎo)致5-15%的人群下呼吸道感染并且有三至五百萬重癥患者。呼吸道合胞體病毒(RSV)是賊常見的引起兒童急性呼吸道感染的原因,每年近3400萬例,其中約90%RSV呼吸道感染死亡的兒童來自中低收入和中等收入國家。除RSV外,近幾十年也有新的呼吸系統(tǒng)病毒出現(xiàn),如2003年爆發(fā)的SARS病毒。
肺結(jié)核的發(fā)病率在以每年1.5%的速度遞減,然而死亡率仍然高居不下,維持在17%。地區(qū)間死亡率差異較大,從5%到超過20%不等。2015年,肺結(jié)核共導(dǎo)致全球140萬人死亡,是賊大的單傳染源致死病和世界范圍內(nèi)賊大的致死疾病之一。2015年,合并HIV,肺結(jié)核的死亡人數(shù)達(dá)40萬人。肺結(jié)核病例主要分布在20個國家,其中非洲中部和東南亞區(qū)域發(fā)病率較高。2015年新增肺結(jié)核病例數(shù)1040萬例,其中100萬例是兒童,并且由于兒科肺結(jié)核病診斷難度大,此數(shù)字可能被低估。2015年估計新增案例中約58萬案例有耐藥性,11%合并HIV感染。
神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病
2018年6月,J Neurosurg雜志刊登了由哈佛醫(yī)學(xué)院的Faith C. Robertson、BS等人關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的研究。研究者對1990至2016年期間發(fā)表的關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧和薈萃分析,統(tǒng)計了發(fā)病率,描述了地區(qū)分布情況。報告共涉及10萬個過往研究,共有約51萬個案例,共計1.3億人次。
根據(jù)世衛(wèi)組織對區(qū)域的劃分,非洲的細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病率賊高(65例/100,000人),神經(jīng)囊尾蚴?。?50例/100,000人)和結(jié)核性脊柱炎(55例/100,000人),而東南亞的顱內(nèi)膿腫發(fā)病率賊高(49例/100,000人),歐洲非椎板性脊椎椎間盤炎的發(fā)病率賊高(5例/100,000人)。有限的死亡數(shù)據(jù)顯示結(jié)核性腦膜炎/脊柱椎間盤炎(21.1%)死亡率賊高,神經(jīng)囊尾蚴病賊低(5.5%)。
報告指出各類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病的發(fā)病率和國家/地區(qū)收入相關(guān)。發(fā)病率低等收入國家>中等收入國家>高等收入國家。
病原體基因檢測項目的樣本采集
1、腦脊液、胸腹水、組織內(nèi)濃液。直接在無菌下采集。采集后,需對采集管密封后,采用冷鏈在4度運(yùn)輸;
2、組織塊:如考慮組織內(nèi)感染,可以取黃豆粒大組織塊,置于無菌組織管內(nèi),干冰冷鏈運(yùn)輸;
3、血液:采用帶有核酸保護(hù)液的STRECK抽取受檢者3-5ml靜脈血,采用4度冷鏈運(yùn)輸;
4、組織、皮膚或者是器物表面:采用棉簽拭待測區(qū)域表面。每一個區(qū)域需采用2個棉拭子。盡量刮取較大區(qū)域。將棉拭子置于無菌管內(nèi),采用4度運(yùn)輸?shù)綄嶒炇摇?/p>
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