【佳學基因檢測】第三代測序是高通量測序嗎？

1.PacBio SMRT單分子測序技術

Pacific Biosciences于2004年成立，2010年納斯達克上市，2011年PacBioRS發(fā)布。

以PacBio測序為代表的第三代基因測序技術逐漸應用到多個科研領域。該平臺利于單分子實時測序技術，又稱作SMRT（Single Molecule Real-Time）測序，基于納米小孔的單分子讀取技術，無需擴增即可快速完成序列讀取。

建庫

因為測序讀長很長，因此可以制備大片段（3-10kb）文庫；不同于其他二代測序文庫，該文庫兩端分別連接環(huán)狀單鏈，單鏈兩端又與雙鏈正負鏈連接，得到類似啞鈴的結構，稱為SMRT Bell。

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測序

SMRT Cell芯片含有數(shù)百萬個納米級的零模波導孔（zero-mode wave guides, ZMWs），ZMW是一個直徑只有10~50nm的孔，引物在模板的單鏈環(huán)部位退火后，這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。

每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序，4種dNTP帶有不同的熒光標記。當激光打在ZMW底部時，只能照亮很小的區(qū)域，DNA聚合酶就被固定在這個區(qū)域。

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只有在這個區(qū)域內，堿基攜帶的熒光基團被激活從而被檢測到。當DNA合成進行時，下一個堿基進行延伸，上一個dNTP上的熒光基團就會被切除，高效了檢測的連續(xù)性。

不同的堿基會發(fā)出不同的光，此時根據(jù)光的波長及峰值便可判斷堿基類型。

2.納米孔測序技術

2005年，牛津納米孔科技有限公司(Oxford Nanopore Technologies)成立，致力于納米孔測序技術的商業(yè)轉化。2014年Nano space單分子測序技術發(fā)布。

牛津納米孔公司開發(fā)的納米單分子測序技術與以往的測序技術皆不同，它是基于電信號而不是光信號。

納米孔測序技術的核心是一種整合了多個跨膜通道蛋白（即納米孔蛋白）的多聚物膜。通過在膜兩側施加電壓從而產生穩(wěn)定的穿過納米孔的電流。當有其他物體穿過納米孔時，會影響電流的大小，從而產生可識別的電信號的變化。

測序時，DNA雙鏈在馬達蛋白的牽引下解螺旋為單鏈DNA，并穿過納米孔蛋白（也叫Reader蛋白）。由于ATCG四種堿基結構和大小的差異，會使電流產生特征性離子電流變化，通過識別這種電信號的變化，從而達到讀取堿基序列的目的。

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不同型號的納米孔測序儀原理非常一致，其核心均為納米孔測序芯片。常規(guī)的納米孔測序芯片整合512個測序通道，每個測序通道包含四個納米孔，官方數(shù)據(jù)顯示單張芯片不間斷測序48h，可產生20-30G的數(shù)據(jù)量。

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二代測序的出現(xiàn)極大地解決了通量問題，在大幅提高測序速度和正確性的同時大大降低了測序成本，但閱讀長度相對較短。而以單分子測序為主要特征的三代測序，正朝著單分子、長讀長、低成本、小型化的方向發(fā)展，實現(xiàn)了測序領域的又一次變革。