【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)揭秘：埃勒斯-當(dāng)洛綜合征（EDS）及其血管型的遺傳奧秘

埃勒斯-當(dāng)洛綜合征基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

埃勒斯-當(dāng)洛綜合征（EDS）是一組異質(zhì)性的結(jié)締組織疾病。它的特點(diǎn)是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的分子異常，如膠原蛋白或其修飾酶。EDS的臨床特征包括皮膚超彈性、大關(guān)節(jié)過度活動(dòng)以及容易淤青。基于臨床經(jīng)驗(yàn)和遺傳發(fā)現(xiàn)，EDS被分為六個(gè)亞型（1997年維爾夫蘭分類）：（1）經(jīng)典型，這是最常見的形式；（2）過度活動(dòng)型；（3）脊柱后凸側(cè)凸型；（4）關(guān)節(jié)松弛型；（5）皮膚松弛型；以及（6）血管型，這是最具戲劇性的形式。EDS亞型的遺傳和臨床發(fā)現(xiàn)指出了EDS綜合征的遺傳異質(zhì)性。因此，正確診斷EDS類型對(duì)遺傳咨詢和管理具有重要意義。EDS的任何亞型都需要特定的生化和基于基因解碼的分子檢測(cè)來支持。

血管型EDS（vEDS），也稱為EDS IV型（NIM#130050），是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，估計(jì)患病率為1/150,000。血管型EDS有四個(gè)主要特征：（1）血管或內(nèi)臟器官（如子宮和腸道）的破裂，（2）不尋常的面部外觀，（3）容易淤青，以及（4）皮膚透明，可見靜脈。在vEDS中，一個(gè)重要的臨床事件是富含III型膠原蛋白的系統(tǒng)動(dòng)脈可能發(fā)生剝離、動(dòng)脈瘤或破裂。這些嚴(yán)重事件也可能自發(fā)發(fā)生。

vEDS的遺傳原因是III型膠原蛋白α1基因（COL3A1）中存在突變，導(dǎo)致成熟III型膠原蛋白蛋白的定性和/或定量異常。III型前膠原蛋白蛋白的每個(gè)氨基酸鏈中都包含343個(gè)甘氨酸（Gly）-X-Y重復(fù)序列（X和Y為任何其他氨基酸）。成熟的III型膠原蛋白纖維由3條α-1(III)鏈組成

埃勒斯-當(dāng)洛綜合征基因檢測(cè)案例介紹

一名38歲的河南女性患者，此前已被診斷為血管型埃勒斯-當(dāng)洛綜合征（vEDS），來到致病基因鑒定基因解碼位于佳學(xué)基因檢測(cè)合作醫(yī)院就診。她曾因乙狀結(jié)腸-直腸缺血性穿孔伴糞性腹膜炎接受了乙狀結(jié)腸-直腸切除術(shù)和造口術(shù)?；颊邿ovEDS家族史。在她26歲時(shí)，尚未被臨床診斷為EDS，她接受了雙足內(nèi)弓矯正和跗骨竇關(guān)節(jié)融合術(shù)的正骨手術(shù)。

致病基因鑒定基因解碼采用下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)，通過目標(biāo)富集技術(shù)調(diào)查感興趣的基因組區(qū)域；該過程使用HaloPlex目標(biāo)富集試劑盒（Agilent Technologies）進(jìn)行。設(shè)計(jì)中包括的九個(gè)基因是根據(jù)其臨床特征選擇的。實(shí)際分析的靶標(biāo)總區(qū)域大小為100,336千堿基對(duì)（kbp），實(shí)際分析的佳靶標(biāo)堿基為99,718 kbp。根據(jù)供應(yīng)商提供的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行富集。在37°C下，使用八種不同的限制反應(yīng)對(duì)總共225納克（ng）的DNA進(jìn)行30分鐘的消化。將八種消化反應(yīng)合并為一個(gè)含有特異性靶標(biāo)探針的雜交混合物。在54°C下進(jìn)行3小時(shí)的雜交反應(yīng)。探針用生物素標(biāo)記，并設(shè)計(jì)為與消化片段的兩端雜交，從而生成包含一個(gè)缺口的環(huán)狀片段。然后，使用鏈霉親和素珠捕獲DNA探針雜交體，以消除線性非靶標(biāo)DNA片段。在第二次連接反應(yīng)中，剩余的缺口被封閉以完成環(huán)化。從珠子上洗脫捕獲的DNA，并通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增。

最后，通過TapeStation軟件測(cè)量了每個(gè)文庫(kù)的濃度，并使用TE將其稀釋至4nmol。通過將不同的基因組文庫(kù)混合，獲得了最終文庫(kù)池，理想的最終濃度為8 pM（集群密度約為900/1000 K/mm²的理想濃度）。捕獲的基因組文庫(kù)通過Illumina MiSeq進(jìn)行測(cè)序，生成了2×150 bp的配對(duì)末端讀數(shù)。

為了理解生成的FASTQ文件（一種存儲(chǔ)生物序列及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的文件）。通過Burrows-Wheeler Aligner對(duì)FASTQ文件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估、修剪、對(duì)齊，并映射到人類參考基因組（GRCh38/hg38）。使用SAM工具對(duì)包括排序、合并、索引和生成每個(gè)位置格式的對(duì)齊在內(nèi)的對(duì)齊操作進(jìn)行處理，以生成BAM文件（用于存儲(chǔ)序列的二進(jìn)制格式）。使用Genome Analysis Toolkit (GATK) 2.0版（美國(guó)馬薩諸塞州劍橋市Broad Institute）進(jìn)行局部重新對(duì)齊、堿基質(zhì)量重新校準(zhǔn)和變異調(diào)用，并應(yīng)用以下質(zhì)量參數(shù)：覆蓋率>20，堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)>30，映射質(zhì)量>20。未通過這些質(zhì)量值的變異被移除。

最后，使用KGGSeq軟件通過不同的參數(shù)（如基因型質(zhì)量過濾器、基因特征過濾器（錯(cuò)義、剪接、移碼）和功能影響過濾器）對(duì)變異調(diào)用文件（VCF）進(jìn)行過濾。通過Sanger方法使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems，Life Technologies）對(duì)通過NGS目標(biāo)富集方法發(fā)現(xiàn)的變異進(jìn)行確認(rèn)，隨后在Applied Biosystems 3130xl上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。使用Sequencher軟件v5.1分析電泳圖。

使用致病基因鑒定基因解碼的定制面板（表1）通過目標(biāo)富集方法進(jìn)行重測(cè)序，結(jié)果顯示COL3A1基因第21號(hào)外顯子1493位存在一個(gè)未被基因檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄突變，導(dǎo)致核苷酸替換（c.1493G>A，p.G498D）。這一突變?cè)诘诙蜠NA提取中通過Sanger方法得到了確認(rèn)。此外，由于患者臨床狀態(tài)極度虛弱，從成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中提取互補(bǔ)DNA（cDNA）進(jìn)行分析并不可行。

COL3A1基因編碼的III型前膠原蛋白由每個(gè)三肽鏈中的343個(gè)Gly-X-Y重復(fù)序列（X和Y為任何其他氨基酸）組成，這是膠原蛋白特異性的一個(gè)特征。成熟的III型膠原纖維由3條α-1(III)鏈組成。COL3A1基因一個(gè)等位基因上的突變導(dǎo)致成熟III型膠原蛋白出現(xiàn)質(zhì)量或數(shù)量上的異常（圖2）[16]。為了評(píng)估該突變的功能效應(yīng)，致病基因鑒定基因解碼使用SIFT、PROVEAN、PolyPhen-2和Align GVGD進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬分析；所有這些工具均預(yù)測(cè)這一變化將導(dǎo)致疾病發(fā)生。

圖2顯示，c.1493G>A，p.G498D是一個(gè)錯(cuò)義變異，導(dǎo)致從中性氨基酸甘氨酸（Gly）到極性氨基酸天冬氨酸（Asp）的替換，且該變異位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三螺旋區(qū)域。

為了研究錯(cuò)義變異的致病特性，使用了不同類型的軟件：SIFT、PROVEAN、PolyPhen-2、Mutation Taster、Grantham距離等。這些工具通過評(píng)估變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能或穩(wěn)定性的潛在影響，幫助確定變異是否具有致病性。通過綜合這些分析結(jié)果，可以進(jìn)一步了解變異的生物學(xué)意義和潛在的臨床影響。

基于兩個(gè)數(shù)據(jù)集（人類多樣性和人類變異）的PolyPhen-2軟件預(yù)測(cè)表明，c.1493G>A，p.G498D對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能具有破壞性，得分為1.000（敏感性0.00；特異性1.00；圖3）。特別是，第1493位的甘氨酸（Gly）在不同物種中高度保守。SIFT和PROVEAN軟件評(píng)估了氨基酸替換是否對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有影響，并證實(shí)了該錯(cuò)義變異的致病性。Align GVGD則根據(jù)氨基酸的生物物理特性預(yù)測(cè)，該變異是不被容忍的C65（GV 0.00；GD 93.77；圖3）。由于目前尚無序列同源性參考來構(gòu)建該結(jié)構(gòu)，因此無法分析該突變對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的影響。

埃勒斯-當(dāng)洛綜合征基因檢測(cè)案例總結(jié)

在《心血管系統(tǒng)疾病及基因檢測(cè)病案集》報(bào)告中，致病基因鑒定基因解碼描述了一名38歲河南女性的病例，她具有血管型埃勒斯-當(dāng)洛綜合征（vEDS）的典型癥狀。她因乙狀結(jié)腸-直腸缺血性穿孔伴糞性腹膜炎接受了乙狀結(jié)腸-直腸切除術(shù)和造口術(shù)。為避免手術(shù)并發(fā)癥，造口術(shù)并未關(guān)閉。她的腸道問題加劇了她的臨床狀況。體格檢查顯示，她的皮膚略顯光滑且半透明，可見靜脈。遺傳分析未確認(rèn)任何家族史。

通過使用基于基因解碼的目標(biāo)下一代測(cè)序（NGS）方法，致病基因鑒定基因解碼在COL3A1基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)致病性突變c.1493G>A，p.G498D（http://www.le.ac.uk/ge/collagen/）。迄今為止，已在COL3A1基因中鑒定出200多種突變，所有這些突變都導(dǎo)致異常III型前膠原蛋白的合成（圖1）。大約三分之二的突變是單核苷酸替換，導(dǎo)致前α1(III)鏈三螺旋結(jié)構(gòu)域中的甘氨酸殘基發(fā)生改變。其余大部分為剪接位點(diǎn)突變，導(dǎo)致外顯子跳躍，盡管其中一些具有更復(fù)雜的后果，且少數(shù)為較大的基因組缺失。突變的性質(zhì)或位置與主要并發(fā)癥的類型或頻率之間無相關(guān)性。

在COL3A1基因中檢測(cè)到雜合子突變c.1493G>A，導(dǎo)致中性氨基酸甘氨酸被極性氨基酸天冬氨酸取代。PolyPhen-2、SIFT、PROVEAN和Align GVGD進(jìn)行的薈萃分析表明，該點(diǎn)突變是致病性的，并且是vEDS表型的原因。甘氨酸的替代對(duì)COL3A1膠原纖維的正常組裝產(chǎn)生負(fù)面影響。事實(shí)上，膠原的特征在于Gly-X-Y（X和Y為任何其他氨基酸）的343次重復(fù)。甘氨酸氨基酸非常重要，因?yàn)樗亲钚〉陌被?，并決定了前α鏈之間通過氫鍵連接的緊密性，從而維持了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

致病基因鑒定基因解碼得出結(jié)論，COL3A1基因中發(fā)現(xiàn)的c.1493G>A，p.G498D是vEDS（血管型埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合征）的原因。甘氨酸替換的特定位置表明基因型與表型之間存在相關(guān)性。c.1493G>A，p.G498D的功能特性尚不清楚，需要進(jìn)一步的體外細(xì)胞培養(yǎng)研究來了解這一新變異與vEDS表型之間的聯(lián)系。在vEDS中發(fā)現(xiàn)這一新變異強(qiáng)調(diào)了基因測(cè)試（如NGS）在罕見遺傳性疾病中的重要性。

圖3：數(shù)據(jù)分析。PolyPhen-2 預(yù)測(cè)表明 c.1493G>A (p.G498D) 可能破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（基于兩個(gè)不同的數(shù)據(jù)集人類多樣性和人類變異）。b Align GVGD 表明 c.1493G>A (p.G498D) 是有害的（類別 65）