【佳學基因檢測】唇裂基因檢測技術(shù)的進展與應用

唇裂（Cleft Lip）是一種常見的先天性顱面畸形，通常分為非綜合征性唇裂伴腭裂（NSCLP）和非綜合征性單純唇裂（NSCLO）。近年來，隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，唇裂基因檢測技術(shù)更新團隊能夠更深入地唇裂致病基因鑒定基因解碼唇裂的遺傳背景，從而為疾病的早期診斷、預防和個體化治療提供新思路?！洞搅寻l(fā)生的原因查找與跟蹤》將介紹唇裂的基因檢測技術(shù)及其在唇裂致病基因鑒定基因解碼和臨床應用中的進展。

樣本收集與唇裂致病基因鑒定基因解碼背景

在唇裂基因檢測的唇裂致病基因鑒定基因解碼中，樣本的收集和分析是關(guān)鍵的第一步。唇裂基因檢測技術(shù)更新團隊在2017年至2019年期間招募了159例NSCL/P患者，其中包括79例NSCLP和80例NSCLO患者，這些患者均在四川大學華西口腔醫(yī)院接受手術(shù)治療。此外，還收集了542名未受影響的對照組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自于佳學基因致病基因鑒定基因解碼的全基因組測序（WGS）數(shù)據(jù)，覆蓋度為39.89×。在隨后的唇裂致病基因鑒定基因解碼中，唇裂基因檢測技術(shù)更新團隊又在2004名NSCL/P患者和1823名對照組中進行了一輪重要單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的復制唇裂致病基因鑒定基因解碼，并在1729名NSCL/P患者、995名非綜合征性腭裂（NSCPO）患者和996名健康對照中進行了第二輪復制唇裂致病基因鑒定基因解碼。所有參與者均為漢族人群。

為了確保唇裂致病基因鑒定基因解碼的倫理合規(guī)性，所有參與者或其監(jiān)護人均簽署了知情同意書。該唇裂致病基因鑒定基因解碼獲得了四川大學華西口腔醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會（WCHSIRB-D-2018-012R1）的批準，并遵循《流行病學觀察性唇裂致病基因鑒定基因解碼報告強化標準》（STROBE）指南。

目標區(qū)域的測序準備與實施

基因選擇與目標區(qū)域

唇裂致病基因鑒定基因解碼人員根據(jù)中國漢族（CHB）和日本（JPT）人群的HapMap連鎖不平衡（LD）結(jié)構(gòu)，選擇了位于IRF6基因周圍的目標區(qū)域進行測序。具體選擇了位于染色體1的209,923,704至210,382,027（Hg19）區(qū)域，長度為458.323 kb，涵蓋了IRF6基因的編碼和非編碼區(qū)域。

測序文庫的制備

為了有效捕獲和富集目標區(qū)域的基因片段，唇裂致病基因鑒定基因解碼團隊使用了Agilent液相捕獲系統(tǒng)（Agilent SureSelectXT Custom Kit）。具體步驟如下：

1. 基因組DNA片段化：使用Covaris粉碎儀將1.0 μg基因組DNA樣本剪切成180至280 bp的片段。
2. 文庫構(gòu)建：進行末端修復和A尾添加，然后將特異性索引接頭連接到片段兩端，以制備DNA文庫。
3. 目標區(qū)域捕獲：將DNA文庫與生物素標記的探針雜交，并通過含鏈霉素的磁珠捕獲目標區(qū)域。
4. PCR擴增與質(zhì)量檢測：對捕獲區(qū)域進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，并進行文庫質(zhì)量檢測。
5. 高通量測序：最終在Illumina Hiseq 4000平臺上進行雙端150 bp的測序。

基因分型與統(tǒng)計分析

基因分型技術(shù)

在復制唇裂致病基因鑒定基因解碼中，選擇的SNPs通過SNPscan方法進行基因分型，該方法基于雙連接和多重熒光PCR。為確保基因分型的準確性，隨機選擇了4%的樣本進行重復分析。

統(tǒng)計分析

使用PLINK軟件對SNP進行統(tǒng)計分析，包括哈迪-溫伯格平衡（HWE）檢驗、關(guān)聯(lián)分析、單體型關(guān)聯(lián)的滑動窗口分析和條件邏輯分析。唇裂基因檢測技術(shù)更新團隊從發(fā)現(xiàn)階段選擇了5個顯著的SNPs進行進一步復制唇裂致病基因鑒定基因解碼，選擇標準如下：

1. 最小次等位基因頻率：GnomAD_EAS_AF和1000基因組_EAS≥0.3。
2. 連鎖不平衡區(qū)塊：根據(jù)1000基因組數(shù)據(jù)庫中的CHS&CHB連鎖不平衡區(qū)塊，選擇標記SNPs以最大限度地覆蓋所有顯著的SNPs。

經(jīng)過Bonferroni多重校正，目標測序階段的關(guān)聯(lián)分析P值顯著性閾值為4.59E-05，第一輪復制Prep1為0.0033，第二輪復制Prep2和綜合P值Pcomb為0.0042。使用Haploview計算成對連鎖不平衡，同時根據(jù)以下公式計算人群歸因風險百分比（PAR%）：PAR% = [Pe (RR − 1) / RR] × 100（Pe為病例中等位基因的流行率，RR為相對風險；比值比OR用作RR的代理）。

定量實時PCR分析

在進行基因表達分析時，唇裂致病基因鑒定基因解碼人員收集了54名NSCLO和32名微型唇裂（MCL）患者的唇部組織樣本，這些樣本是在患者約1歲時進行唇裂修復手術(shù)時收集的。樣本總RNA使用RNA-easy Isolation Reagent（Vazyme）提取，并使用PrimeScript RT試劑盒和TB Green Fast qPCR混合物（Takara）進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA和進一步的定量實時PCR（RT-qPCR）分析。最終，使用GAPDH作為參考基因，通過2–ΔΔCt方法分析IRF6的相對表達水平。

基因檢測的臨床應用與展望

基因檢測的應用

唇裂的基因檢測技術(shù)不僅在基礎(chǔ)唇裂致病基因鑒定基因解碼中具有重要意義，也在臨床應用中展現(xiàn)出巨大潛力：

• 早期診斷：通過基因檢測，可以在嬰兒出生前識別出唇裂的風險，為早期干預提供機會。
• 個體化治療：了解患者的基因變異有助于制定個性化治療方案，提高治療效果。
• 遺傳咨詢：基因檢測結(jié)果可為家族提供遺傳咨詢，幫助家族成員了解自身和后代患病風險。

唇裂致病基因鑒定基因解碼進一步提升計劃

盡管基因檢測在唇裂風險評估中顯示出巨大潛力，但仍面臨一些挑戰(zhàn)：

• 準確性和可靠性：基因檢測的準確性和可靠性需要在不同人群中進行驗證。
• 倫理和隱私問題：基因檢測涉及倫理和隱私問題，需要妥善處理。
• 跨學科合作：基因檢測的進展需要生物學、醫(yī)學和數(shù)據(jù)科學等多個學科的緊密合作。

總之，唇裂基因檢測技術(shù)的發(fā)展為疾病的早期診斷、預防和個體化治療提供了新的可能。隨著技術(shù)的不斷進步和唇裂致病基因鑒定基因解碼的深入，基因檢測將在唇裂的預防和治療中發(fā)揮更大作用。通過進一步的唇裂致病基因鑒定基因解碼和臨床應用，基因檢測將為患者和家庭帶來更多的益處。